【生信进阶练习1000days】day11&day12-GEO data mining

GEO数据挖掘

0. 安装并加载包

if (!requireNamespace("BiocManager", quietly = TRUE))
  install.packages("BiocManager")
BiocManager::install("KEGG.db",ask = F,update = F)
BiocManager::install(c("GSEABase","GSVA","clusterProfiler" ),ask = F,update = F)
BiocManager::install(c("GEOquery","limma","impute" ),ask = F,update = F)
BiocManager::install(c("genefu","org.Hs.eg.db","hgu133plus2.db" ),ask = F,update = F)
install.packages('WGCNA')
install.packages(c("FactoMineR", "factoextra"))
install.packages(c("ggplot2", "pheatmap","ggpubr"))

library("FactoMineR")
library("factoextra")
library(GSEABase)
library(GSVA)
library(clusterProfiler)
library(genefu)
library(ggplot2)
library(ggpubr)
library(hgu133plus2.db)
library(limma)
library(org.Hs.eg.db)
library(pheatmap)

1. 下载GSE数据和探针注释

1.1 下载GSE数据

setwd("E:/GitHub/Bioinformatics-1000days/day11-GEO/")
f='E:/GitHub/Bioinformatics-1000days/day11-GEO/GSE42872_eSet.Rdata'
library(GEOquery)
if(!file.exists(f)){
  gset <- getGEO('GSE42872', destdir=".",
                 AnnotGPL = F, ## 注释文件
                 getGPL = F) ## 平台文件
  save(gset,file=f) ## 保存到本地
}

下载后加载数据

load('E:/GitHub/Bioinformatics-1000days/day11-GEO/GSE42872_eSet.Rdata') ## 载入数据
class(gset) #查看数据类型
length(gset) #
class(gset[[1]])
gset

获取gset中的表达矩阵数据和临床表型数据

a=gset[[1]] #
dat=exprs(a)  # 使用exprs函数取出表达矩阵
boxplot(dat,las=2) # 看一下数据分布的箱线图
pd=pData(a) # 使用pData函数取出表型数据
head(pd) # 看一下表型数据情况

可以看到pd表型数据的title中显示了表型的处理情况

                                     title geo_accession                status
GSM1052615     A375 cells 24h Control rep1    GSM1052615 Public on May 20 2014
GSM1052616     A375 cells 24h Control rep2    GSM1052616 Public on May 20 2014
GSM1052617     A375 cells 24h Control rep3    GSM1052617 Public on May 20 2014
GSM1052618 A375 cells 24h Vemurafenib rep1    GSM1052618 Public on May 20 2014
GSM1052619 A375 cells 24h Vemurafenib rep2    GSM1052619 Public on May 20 2014
GSM1052620 A375 cells 24h Vemurafenib rep3    GSM1052620 Public on May 20 2014

所以我们就把title中的这个处理分组提取出来

library(stringr)
group_list=str_split(pd$title,' ',simplify = T)[,4] ## title中由于是空格号隔开的，所以分割后，取第四列就是表型处理分组的信息：Control 和 Vemurafenib
table(group_list) ## table()函数 以因子表格的方式，用于计数每个元素出现的次数
#>group_list
#>    Control Vemurafenib 
#>          3           3 

1.2 下载探针注释数据

探针注释数据有三种获取方法，法1：直接通过getGEO函数下载GEO上准备好的soft文件注释，法2：各大芯片厂商有的会将芯片注释封装成R包，所以可以下载R注释包来注释芯片，法3：直接去芯片厂商官网下载芯片注释。（比较麻烦）
此处我们直接下载GEO上的soft注释，来作为我们芯片探针的注释

  library(GEOquery)
  library(tidyverse)
  #Download GPL file, put it in the current directory, and load it:
  gpl <- getGEO('GPL6244', destdir="E:/GitHub/Bioinformatics-1000days/day11-GEO/")
  colnames(Table(gpl))  ## Table函数用于提取soft文件
  head(Table(gpl)[,c(1,1:11)]) ## you need to check this , which column do you need
  tmp <- Table(gpl) ## gene name is in "//",we should separate them
  tmp <- separate(tmp,gene_assignment,into = c("ensembl_id","geneSymbol","other"),sep = "//")
  probe2gene=tmp[,c(1,11)]
  head(probe2gene)
#  library(stringr)  
  save(probe2gene,file='probe2gene.Rdata') ## 保存芯片探针注释

1.3 将表达矩阵中的探针id 转换为 基因symbol

# load(file='probe2gene.Rdata')
# ids=probe2gene

 

1.4 表达矩阵检验

下载完表达矩阵后，要仔细check一下表达矩阵是否正确，id转换有没有出错（基因和probe_id对应的是对的）
所以就要画一系列的图来看数据的整齐性等等
首先，对所有样本画boxplot 查看样本数据的整齐性
样本数据只要基本都在同一条线上，那么就说明样本之间是可以比较的

• 如果不可比较，就用sv包的 combine()函数矫正

PCA图
看PCA图 可以使用ggfortify画图

2. 差异基因表达分析

使用limma包对表达矩阵进行差异基因分析

rm(list = ls())
options(stringsAsFactors = F)
load(file = 'step1-output.Rdata') # 加载上一步处理好的表达矩阵数据和分组信息
library(limma) ## 关于limma的使用 可以参考limmaUsersGuide()来查看使用指南

2.1 设计分组信息

limma包的说明书里给出过很详细的关于实验设计分组的方法（limmaUsersGuide(),查看P35-P40页）
我们的数据是6个样本，3个是用了药的黑色素瘤细胞，另外3个是未用药的细胞样本
因此这样来设计我们的分组信息

design <- model.matrix(~0+factor(group_list))  # group_list是一个向量的分组信息
# 使用model.matrix来构建分组
colnames(design)=levels(factor(group_list))     # 设置分组的colname  
head(design) # 查看分组情况
# Control Vemurafenib
#1       1           0
#2       1           0
#3       1           0
#4       0           1
#5       0           1
#6       0           1
exprSet=dat # 将表达数据赋给exprSet
rownames(design)=colnames(exprSet) # 用样本名给分组信息添加行名
design # 查看分组信息
#           Control Vemurafenib
#GSM1052615       1           0
#GSM1052616       1           0
#GSM1052617       1           0
#GSM1052618       0           1
#GSM1052619       0           1
#GSM1052620       0           1

contrast.matrix<-makeContrasts("Vemurafenib-Control", levels = design) # 使用makeContrasts函数构建比对的矩阵分组
contrast.matrix #这个矩阵声明，我们要把 Tumor 组跟 Normal 进行差异分析比较

2.2 差异分析

##step1
fit <- lmFit(exprSet,design)
##step2
fit2 <- contrasts.fit(fit, contrast.matrix)  
fit2 <- eBayes(fit2) ## default no trend !!!
##eBayes() with trend=TRUE
##step3
tempOutput = topTable(fit2, coef=1, n=Inf)
nrDEG = na.omit(tempOutput) 
#write.csv(nrDEG2,"limma_notrend.results.csv",quote = F)
head(nrDEG)
deg = nrDEG
save(deg,file = 'deg.Rdata')

2.3 绘制火山图

2.4 绘制热图

待续