Week 6 转座子-转座重组-分析转座的实验

http://mooc.guokr.com/note/19349/

Lecture 11: Mechanism of Transposition转座机制

Segment 1: Introduction

• 基因重组分为三大类：
  同源重组 (homologous recombination)：两个基因之间发生同源重组的概率取决于它们在染色体上相隔的距离。如果它们在同一染色体上离得很近，那它们同源重组的概率就比较低；与此相反，如果它们离得很远，那它们之间发生同源重组的概率就会高得多。可以通过研究特定基因之间同源重组发生的概率来推测它们在染色体上的排列顺序。

• 位点专一性重组 (conservative site-specific recombination)、
• 转座重组 (transposition)：一段DNA序列从基因组的一个位置“跳跃”到另一个位置

Segment 2: Introduction to Transposable Elements转座子

转座子 (Transposable elements) 是一类在染色体中可移动的一段DNA序列

VDJ重排

Segment 3: History and the Three Classes of Transposition

• 芭芭拉·麦克林托克 (Barbara McClintock)在玉米遗传学研究中通过研究玉米粒颜色的不同首次发现了转座子

• 转座因子分为三种不同类别：
  第一种 经典DNA转座子 总是DNA构成，并且转座后还是DNA。经典DNA转座子又分为两类，一类是每次移动都会进行复制；另一类是移动时不进行复制。
  第二种 类逆转录病毒转座子，包括逆转录病毒和类逆转录病毒转座子，会有RNA作为中间产物，但实际上当它们处于DNA阶段时，其重组机制和经典DNA转座子非常相似
  第三种 非病毒家族转座子

Segment 4: Defining DNA Transposition and Transposons定义基因转座和转座子

转座子结构

Segment 5: 转座机制-剪切和粘贴Transposition Mechanism - Cut and Paste

DNA两端剪开

剪切下的转座子通过一步酯基转移反应攻击目标DNA上的两个磷酸二酯键，以插入

插入宿主DNA，之后把切口缝合

Segment 6:转座子切除机制 Transposon Excision Mechanisms

为了产生剪切粘贴型转座，就要使转座子两端出现双链断裂，将其完整地从旧位点切出来，移到新位点
，进行此反应的方法有很多种，这里说三个有趣的例子。

Segment 7: 复制型转座机制Transposition Mechanism - Replicative

Segment 8: 类病毒的反转录转座子的转座机制Transposition Mechanism of a Retrotransposon

Segment 9: 区分不同的转录机制Distinguishing Between Transposition Mechanisms

Lecture 12: 分析转座的实验Assays for Transposition

Segment 1: Assays for Transposition

Segment 2: Sectoring杂色图样 Assays

菌落的白色面积越大，说明含有转座子的含量越高

转座子本身携带者redGene，但只有进入宿主细胞之后才会表达，所以被转座子侵占才细胞都会变红

Segment 3: 交配实验Mating-Out Assay

利用了转座生物表型变化，称为接合实验或交配实验

donor cell 包含chromosome、donor plasmid和F（conjugal） plasmid三部分，其中黄色的显示抗药基因

将donor cell与受体细胞混合，一种可能是只有conjugal plasmid移到了受体细胞

或是带着转座子的conjugal plasmid移到了受体细胞

只要看受体细胞对何种抗生素敏感或耐受，就能知道转入的类型及发生频率
这个实验通常会有三个结果：

第一个 受体细胞耐氨苄西林 对四环素和卡那霉素敏感

第二个 受体细胞耐amp和tet，但对kan敏感

第三个 受体耐amp、tet和kan，这说明供体质粒和F质粒融合在一起，一起进入受体细胞，采用了前面介绍的复制型转座机制

Segment 4: Sleeping Beauty

从人类细胞中得到无活性的转座因子序列，从这些序列信息中，试图重拼出原始转座子的样子
通过重拼序列 ，得到有活性的原始转座子，这种重组实验有几个不同的版本，这个版本叫睡美人，因为这些因子在沉睡了很多很多很多年后被重新唤醒

只有当neo耐药基因和transposase同时存在时，才能促进耐药性菌落的生长，如第三列所示

Segment 5: Genomic Southern Blot

这能观察全染色体，但只探查特定序列

Segment 6: 反向PCR Inside-Out PCR

Segment 7: Conclusion