P.371免疫与血清学基本技术

第一节 免疫学基本知识

一、抗原

抗原：能与T细胞及B细胞的受体结合...产生抗体or致敏淋巴细胞，并与之结合、发挥免疫效应的物质。
2个重要特性：

1. 免疫原性（异物性）--抗原刺激机体产生免疫应答，诱生抗体or致敏淋巴细胞的能力。
2. 抗原性--抗原与其诱生的抗体or致敏淋巴细胞特异性结合的能力。

完全抗原、半抗原--有抗原性无免疫原性。

决定Ag特异性的最小化学亚单位--决定簇（又称表位）
其与胸腺的关系区分

• 胸腺依赖抗原（TD-Ag）☆绝大多数蛋白质抗原：病原微生物、血细胞、血清蛋白
• 胸腺非依赖抗原（TI-Ag）

抗原的特异性--免疫应答中最重要特点、理论依据。
血型抗原有：A抗原、B抗原→刺激机体抗A、抗B抗体
血型抗原是同种异型抗原（同一种属不同个体间遗传标记不同）
器官移植排异反应也是同种异型抗原所致
佐剂的主要机制--增强机体对Ag的免疫应答。

二、抗体

抗体：抗原刺激机体由B细胞产生的，本质是免疫球蛋白（Ig）
Ig基本结构：4条肽链（2条轻链-L链、2条重链-H链），由二硫键连接。
可变部位（V）、恒定部分（C）
L链=VL＋CL；H链=VH＋CH
CH=CH1、CH2、CH3
铰链区在CH1、CH2之间水解位置
IgM、IgE还有CH4

• 木瓜酶水解：IgG=2Fab＋Fc（Fab是Ig与Ag结合部位、Fc是可结晶部分）
• 胃蛋白酶水解：IgG=F(ab')2＋Fc（F(ab')2是2个Fab连在一起）

Ig分类：依据H链（重链）的结构特点、主要依Fc部分（CH）恒定重链
（依据重链分）五大类：IgG、IgM、IgA、IgE、IgD
Ig同种型--H链的特性
同类Ig分型依据L链（轻链）结构特点： κ型和λ型
Ig的Fc段可与某些细胞的Fc受体结合（如巨噬细胞）
SPA可与（IgG）的Fc段结合
Ig的F(ab')2是与Ag结合部：VH＋VL是F(ab')2中的高变区、直接与Ag结合的部位。
人类5中Ig特色：

• IgM 分子量最大、早期产生的Ab主要为IgM
• IgG 血清中含量最高、唯一能通过胎盘的Ig
• IgA 经J链连接、可形成多聚IgA。（二聚体）与分泌片结合后（SIgA）→能抵抗蛋白酶水解，局部Ab（黏膜局部抗感染作用）
• IgE 可与肥大细胞膜上Fc受体结合（Ⅰ型过敏反应）

三、抗原抗体反应

抗原物质→相应的免疫细胞→结合在其表面受体→激发相应的抗体→与这种抗体特异性结合。
抗原抗体结合为非共价结合、相对稳固（可洗脱-用于提纯）、特异性的→免疫学测定的基础
抗原抗体的结合→导致补体的激活→最终引起杀细胞or杀菌作用
→结合于吞噬细胞的受体→引起吞噬作用

四、补体（C）

存在于血清中、不耐热、辅助抗体介导的溶菌作用、是抗体发挥溶细胞作用的必要补充条件→补体
补体有9种成分、11种蛋白：C1（q，r，s）、C2~C9。对温度很敏感、易被破坏
补体系统包括补体及D、P、B等因子、约20种成分。
补体激活2个途径：

• 传统途径（第一途径）：被Ag-Ab免疫复合物(IC)活化。活化顺序是C142356789
• 旁路途径（第二途径）：被细菌脂多糖激活

补体激活是一种酶促级联反应：第一种成分激活后、催化下一种成分的生物活性（酶or炎症诱导成分）。
补体最后3种成分聚合成“终末复合物”→插入细菌外膜→导致细菌死亡。

五、免疫系统

1. 免疫器官
2. 中枢免疫器官：骨髓、胸腺、法氏囊（禽类）
3. 周围免疫器官：脾脏、淋巴结、皮肤免疫系统、黏膜免疫系统
4. 免疫细胞
   干细胞、淋巴细胞系（Th、Tc、Ts、Tdh、Bc浆细胞等）、单核细胞、巨噬细胞、肥大细胞、NK(natural killer)细胞等。
   单核细胞、巨噬细胞（这2个都是吞噬细胞）产生IL-1（一种细胞因子、即白细胞介素1）
5. 免疫分子
   Tcr、Bcr、CD、MHC、Ig、补体、细胞因子（IL-1、IL-2……）

六、各免疫细胞特点

1. T细胞
   分成几个群、Th细胞（就是CD4＋...）很重要、成熟需要胸腺加工。Ts细胞是抑制细胞、Tc是细胞毒细胞（直接特异性杀伤靶细胞）
   CD4＋可被PWM等刺激有丝分裂、细胞免疫、CD8＋免疫调节
   T细胞定位于淋巴结副皮质区。
2. B细胞
   B淋巴细胞主管体液免疫调节。BC成熟在骨髓（相当于法氏囊）
   活化BC可衍变成→浆细胞→产生Ab
   PWM可刺激BC有丝分裂

外周血中、T细胞：B细胞=2:1

3. 单核类细胞
   无Ag受体、处理加工Ag、向T细胞呈递Ag

七、过敏反应（变态反应）

过敏反应是4个型

• Ⅰ型（速发型）IgE抗体导致、IgE与肥大细胞的Fc受体结合→出现过敏。如青霉素过敏（皮内注射过敏原）
  慢性寄生虫感染、IgE抗体↑显著
• Ⅱ型（溶细胞型）IgM、IgG抗体及补体介导
• Ⅲ型（免疫复合物型or血管炎型）IgM、IgG抗体及补体介导
• Ⅳ型（迟发型）Tdh细胞释放淋巴因子所致。如结核菌素过敏试验（皮内注射过敏原）

第二节 抗体检测

一、抗体检测基本原理

建立显示系统→看不见的抗原-抗体反应→可看见、可测定的反应
不同方法→本质上只有显示系统的差异→决定了抗体检测的灵敏度
使用已知的抗原→抗原可能是混杂的物质→使用的抗原种类→决定了抗体检测的特异性

二、抗体检测方法

（一）中和反应

不仅测抗体是否存在、而且测定抗体是否具有免疫保护作用。
基本方法：待检物质（抗体？）与活的致病微生物混合→感染动物or敏感细胞→观察发病or细胞病变
细胞的中和试验只反映抗体阻断病毒进入细胞的能力

（二）沉淀反应（检测到2~20 mg/ml水平的抗体）

☆
可溶性抗原与相应抗体结合→出现沉淀物--沉淀反应

1. 单向免疫扩散
   已知抗原混入琼脂→琼脂板打孔→抗体加入孔中扩散→扩散中形成以抗体孔为中心的抗原抗体沉淀环
   测血清中IgG、IgM、IgA、补体C3的含量
2. 双向免疫扩散
   抗原抗体分别加入琼脂凝胶、自由扩散、相遇处形成沉淀线。
   定性定量检测

（三）凝集反应（可检测到1 μg/ml）

细菌、红细胞等颗粒性抗原与相应抗体结合后形成凝集团块--凝集反应

1. 直接凝集
   细菌与红细胞与抗体直接反应、出现细菌or红细胞凝集现象。
2. 玻片凝集试验：定性测抗原、快速真的
3. 试管凝集试验：定量测抗体（系列稀释待检血清）

温箱中放24 h后取出反应管、在室温放2 h再判断为宜
判定凝集滴度以凝集程度为＋＋而定。

2. 间接凝集
   可溶性抗原包被在红细胞or乳胶颗粒表面、与抗体反应→出现颗粒凝集
   γ球蛋白包被的乳胶颗粒→测抗γ球蛋白的抗体（类风湿因子）

（四）补体参加的反应

抗体与红细胞上的抗原结合→激活补体→导致红细胞溶解→溶血现象作指示系统--结果判定

• 补体结合试验
• 溶血空斑试验

（五）用标记抗原进行的抗原抗体反应

利用荧光素、酶、放射性核素标记抗原or抗体
灵敏度高、快速、可定性、定量or定位

1. 免疫荧光--测抗体
   颗粒抗原固定于载玻片→加血清反应→加荧光素标记的抗体→荧光显微镜观察
2. 酶免疫测定--灵敏度ng/ml~pg/ml☆
   酶标记的抗体进行反应、可目测定性or酶标仪测光密度值（OD）
   标记常用的酶：辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶
   常用方法：ELISA
3. 放射免疫测定法--灵敏度pg/ml☆
   放射性核素125 I、141 I标记抗原→测抗体
4. 免疫印迹法
   把电泳区分的蛋白质抗原转移至NC、PVDF 等膜上。
   测血清HIV抗体

三、抗体检测使用的抗原

细菌、病毒都含有多种抗原物质、反应性非常复杂。

1. 全菌or全病毒抗原
   将细菌、病毒直接杀死后作抗原
   细菌凝集实验、免疫荧光检测
   成分复杂、交叉反应
2. 替代抗原
   使用有交叉反应的抗原物质来测定抗体

• 立克次体病→变性杆菌抗原
• 梅毒→牛心脂抗原

3. 粗提取抗原
   仍会含有少量杂散蛋白质、仍存在交叉反应
4. 精提纯抗原
   达到“层析纯”、最可靠结果、但不排除不同微生物的共同抗原
   分子克隆的蛋白质≠精提纯抗原、因为克隆必须在载体中表达
   某些疾病抗原的特异性不明确→需要蛋白印迹试验

四、抗体本底测定

大规模疾病监测中，无疾病人群or动物中显示一定程度的反应--抗体本底
本底抗体的来源：

1. 杂散抗原
   杂散抗原产生低滴度抗体→反映其他类型的感染or未知来源产生的抗体
2. 共同抗原
   任何基因都可能转移、抗原可能存在未知的来源、可以在无疾病个体产生高滴度抗体
3. 既往感染
   疾病过程产生的抗体成了→本底抗体
   抗体本底测定主要目标→建立疾病的判定标准、运用数理统计方法确定判别值。

第三节 细胞免疫检验

一、淋巴细胞的分类与类型鉴定

先制备外周血单个核细胞（PBMC）。常用方法是葡聚糖-泛影葡胺（淋巴细胞分离液）密度梯度离心法。
检测淋巴细胞的表面标志、确定细胞类型

1. 免疫荧光法
   直接or间接免疫荧光法检查淋巴细胞的表面标志
   如CD4+、CD8+细胞亚群，表达mIgD、mIgM的B细胞亚群
2. 磁珠分离法
   磁珠通过抗体结合相应细胞群/亚群表面、借助磁场分开细胞
3. 淘选法
   将已知抗-细胞表面标记-的抗体包被培养皿、加淋巴细胞悬液、细胞与抗体结合→黏附于固相→分离
4. 流式细胞术
   使用流式细胞仪
   借助荧光激活细胞分选器（FACS）对细胞鉴定和分类 sorting

二、免疫细胞功能测定

（一）T细胞功能测定

1. T细胞增殖试验
   3H-TdR掺入法
   PBMC中加入植物血凝素（PHA）共同培养、终止培养前8~15h加入3H-TdR。3H-TdR能掺入细胞合成的DNA中、增殖水平↑、掺入的放射性核素↑
   检测放射活性→测定细胞增值情况
2. 细胞毒试验（杀伤靶细胞）
3. 51Cr释放法
   用Na2CrO4标记靶细胞、待检细胞杀伤靶细胞、测51Cr从靶细胞内释放
4. 乳酸脱氢酶释放法
   效应细胞与靶细胞比例混合、靶细胞被杀伤后、细胞膜释放出乳酸脱氢酶→光度计测定溶液中酶的含量。
   反映效应细胞的杀伤活性。
5. 皮肤试验
   根据局部红肿、迟发型超敏反应的强度检测
   常用：结核菌素、麻风菌素

（二）B细胞功能测定

1. B细胞增殖试验
   B细胞受丝裂原刺激后增殖、检查细胞数目。
2. 抗体形成细胞测定
   溶血空斑试验测定
   SRBC（绵羊红细胞...）、待检B细胞、补体、琼脂糖混合、倾斜平皿、温育1-3 h、肉眼观测分散的溶血空斑出现、每个空斑含一个抗体形成细胞、空斑数即为抗体形成细胞数

三、免疫细胞因子测定

1. 免疫学检测法
   用细胞因子单克隆抗体包被固相的双抗体夹心法or酶联免疫斑点试验（ELISPOT）测定法
   也可用荧光素标记抗细胞因子抗体、对稀薄内细胞因子染色、直接用FACS分析法测定产生该细胞因子的细胞比例
2. RT-PCR法

第四节 抗原检验

一、抗原检验的目的

1. 疾病的快速诊断--早期诊断
2. 病原微生物鉴定

• 确定其血清型
• 确定其致病性

3. 生物活性物质的抗原分析
   利用抗原检测方法确定其生物活性

二、抗原的检测方法

“抗体检测”一节中方法的反向运用

三、单克隆抗体的应用

一种B淋巴细胞抗原刺激后、只能产生一种抗体→称为单克隆抗体
特点

• 理化性状高度均一
• 生物活性单一
• 特异性强
• 便于处理和质控
• 来源容易

用于诊断疾病、检测肿瘤抗原、淋巴细胞表面标志、机体微量成分测定
单克隆抗体还可以用于：

1. 亲和层析的配体
   从复杂混合物中分离、纯化特定成分
2. 生物治疗的导向武器
   脂质体既亲水又亲油
   包有细胞毒剂的脂质体膜上偶联抗体→定向攻击靶细胞--称为免疫脂质体
   如热敏免疫脂质体-抗人乳癌细胞抗体...
3. 免疫抑制剂
   抗人T淋巴细胞单抗（McAb）--治疗排斥反应
4. 研究工作中的探针
   单抗只与抗原分子上某一表位结合
   荧光标记单抗做探针→确定大分子在细胞中的位置和分布
5. 增强抗原的免疫原性