BBQ(生物信息基础问题31)：RNA-Seq建库用哪种策略？

今天我们讨论的是RNA-Seq建库策略问题，我们来思考一下如何对RNA进行测序呢？

Q1：现在可以直接对RNA的序列进行测序吗？
A：肯定是不行的，因为现在没有仪器可以去测RNA序列（太不稳定了）

Q2：那测RNA用什么方法呢？
A：现在的测序仪进行测序的一定都是DNA片段！因此，我们需要把RNA变成DNA，然后加上Adapter（接头序列）进行测序。

RNA-seq建库策略

图片来自 https://journals.plos.org/ploscompbiol/articleid=10.1371/journal.pcbi.1004393

  我们都知道，细胞中的RNA有rRNA, tRNA, mRNA, lncRNA等等。细胞中含量最多的是rRNA，其次是tRNA，mRNA与lncRNA只占大约5%左右甚至更低，而我们真正关心的往往就是mRNA与lncRNA代表的基因表达量。那么怎么对mRNA或者是lncRNA进行富集呢？

Q4：首先我们来了解一下，在正常人类细胞中rRNA，tRNA，mRNA的大致比例是多少？

一个正常细胞的RNA含量

RNA的含量

图片来自： http://www.liankebio.com/wap/article-681.html

  一般来说，我们做RNA-Seq的假设是基于：

某一个条件影响了表型 -->
假设，表型是由蛋白的变化引起的 -->
假设，蛋白的变化大概率是由对应gene表达量的改变引起的 -->
因此，需要对gene进行定量 -->
最终，进行RNA-Seq

（ps:在这种情况下，和正常的相比，RNA的表达肯定存在差别。基于此，可以进行后续的分析）

现有的有2种建库策略：

1：polyA + 建库策略

  在绝大多数情况下，我们关心的gene都是protein coding gene或者是与其结构非常详细的lncRNA（long non-coding RNA）这些gene在形成成熟的mRNA以后，往往都会在3'末端带有polyA 尾巴。与此同时，成熟的tRNA，rRNA，miRNA等等都不带有经典的polyA尾巴。

成熟的RNA

  如果我们使用一段 带有能与A配对的T的磁珠就可以与对应的带有polyA尾巴的RNA结合，随后再经过随机打断，反转录，加adapter就可以完成建库，这样的建库策略叫做polyA + 或者 polyA positive。核心是对带有polyA尾巴的RNA进行富集。

Q5：是不是所有人类的protein coding gene的mRNA都带有polyA尾巴？如果不是请举例；
A：并不是，组蛋白的mRNA就没有polyA尾巴。polyA对mRNA起到稳定作用 即使其不被降解.组蛋白mRNA3'端是一茎环结构 所以组蛋白mRNA降解机制也与其他mRNA不同.

2： rRNA -建库策略

  那么polyA positive策略有个比较大的问题就是，会丢掉很多不带有polyA尾巴的RNA序列，比如tRNA，比如有些lncRNA以及一些特殊的mRNA。同时，我们知道细胞中含量占绝大多数的是序列重复的rRNA，如果我们把rRNA去除之后也就可以顺利进行建库测序。这个过程是对rRNA进行若干次的消化，使得rRNA都被降解而其他类型的RNA不受影响。随后再进行随机打断，反转录，加adapter。这种RNA-Seq的建库策略为rRNA - 或称为 rRNA minus。这种策略的核心是尽可能多的去除rRNA。

Q6:如果一个实验想要探索与可变剪切相关的内容，应该选择polyA +的建库策略还是选择rRNA - 的建库策略？为什么？
A：采取第一个polyA+建库策略。因为研究可变剪接的话，最后得到的都是成熟的mRNA.那么它都具有polyA,在这种情况下利用带T的磁珠进行特异性富集，将mRNA进行富集。然后建库就可以。

Q7:rRNA minus与polyA positive这两种建库策略，哪种最终比对到参考基因组的比例会高一些？为什么？
rRNA minus只是去掉了rRNA,其他的RNA没有去掉，比如说mRNA,lncRNA等等。在mapping回基因组的时候，reads的数量会多。从已知的参考基因组上来看，虽然hg38和hg19差别不大，hg38的mapping结果估计会比hg19高一些。

Ref:
1:生物信息学100个基础问题 —— 第31题 RNA-Seq建库用哪种策略？https://zhuanlan.zhihu.com/p/37081245
2:https://journals.plos.org/ploscompbiol/articleid=10.1371/journal.pcbi.1004393
3:http://www.liankebio.com/wap/article-681.html