高通量测序数据处理学习记录（七）：使用ChIPQC包检查ChIP-seq的质量

参考文章

六六
这篇文章的作者看来是详细的观看了ChIPQC manual并且参考了已有文档进行了学习和实践。
Manual见Manual。

讨论

问：为什么有了参考文章还要发文呢？
答：因为参考文章只是重现了作者的vignette而已，本人在实战过程中就遇到了无数的问题，花费了一天的时间才完成整个分析(包括重装了R +-+)，还在Biostar&Bioconductor forum上发了两篇post:
Question: ChIPQC BiocParallel errors
Question: ChIPQC ERROR with "subscript out of bounds"

分析重现 → 原版pdf

1. 介绍

ChIPQC是一个用来分析ChIP-seq数据的Bioconductor包，它整合了可视化以及统计分析，用以处理比对完成的bam文件（需要peak文件）。
这个包主要有两个函数：

• ChIPQCsample()函数负责对单个ChIP-seq数据进行质控生成报告
• ChIPQC()函数可以对一组数据进行质控并生成报告

ChIPQC需要准备一个信息列表，提供给的ChIPQC()函数构建ChIPQCexperiment object

2. 示例

2.1 准备experiment sample sheet

ChIPQC包自带了准备好的sample信息表，但是未准备bam文件及peak文件，因为bam文件太大了，我们可以先看一下sample文件：

> library(ChIPQC)
> samples = read.csv(file.path(system.file("extdata", package="ChIPQC"), "example_QCexperiment.csv"))
> samples
  SampleID  Tissue Factor Replicate            bamReads                           Peaks
1   CTCF_1    A549   CTCF         1 reads/SRR568129.bam peaks/SRR568129_chr22_peaks.bed
2   CTCF_2    A549   CTCF         2 reads/SRR568130.bam peaks/SRR568130_chr22_peaks.bed
3   cMYC_1    A549   cMYC         1 reads/SRR568131.bam peaks/SRR568131_chr22_peaks.bed
4   cMYC_2    A549   cMYC         2 reads/SRR568132.bam peaks/SRR568132_chr22_peaks.bed
5   E2F1_1 HeLa-S3   E2F1         1 reads/SRR502355.bam peaks/SRR502355_chr22_peaks.bed
6   E2F1_2 HeLa-S3   E2F1         2 reads/SRR502356.bam peaks/SRR502356_chr22_peaks.bed

上图包含了所有必须的信息，bamReads和Peaks的参数是相对路径，当然你也可以指定直接路径，可以看出来这就是一个data.frame，在R里面都可以直接自己构建。

2.2 构建一个ChIPQCexperiment object

exampleExp = ChIPQC(samples, annotation = "hg19"， blacklist = NULL, chromosome = "chr18")

这个里面需要注意的是，annotation是指你使用的参考基因组，其中一下物种的参考基因组的指定已经内置：

“hg19”: Human, version 19
“hg18”: Human, version 18
“mm10”: Mouse, version 10
“mm9” : Mouse, version 19
“rn4” : Rat, version 4
“ce6” : C. Elgans, version 6
“dm3” : D. Melanogaster, version 3

其中blacklist位置是需要不加以分析的区域，不理解的请去Google一下就可以，每个物种的blacklist是可以从UCSC上下载得到的。
另外，需要注意的是，chromosome参数也很重要，当你不去指定的时候，只会默认读取第一条序列进行统计。
作者的包里面内置了构建好的ChIPQCexperiment object，使用data(example_QCexperiment)调用：

> data(example_QCexperiment)
> exampleExp
Samples: 6 : CTCF_1 CTCF_2 ... E2F1_1 E2F1_2 
        Tissue Factor Replicate Peaks
CTCF_1    A549   CTCF         1  1118
CTCF_2    A549   CTCF         2   648
cMYC_1    A549   cMYC         1   253
cMYC_2    A549   cMYC         2   159
E2F1_1 HeLa-S3   E2F1         1   325
E2F1_2 HeLa-S3   E2F1         2   249
        Reads Map% Filt%   Dup% ReadL FragL RelCC  SSD  RiP% RiBL%
CTCF_1 341055  100  26.3 16.600    28   131 2.740 2.53 31.20  1.33
CTCF_2 303856  100  28.4  7.320    28   131 2.690 1.43 12.80  0.00
cMYC_1 287462  100  31.0 13.600    28    97 0.347 1.47  6.59  1.78
cMYC_2 317537  100  29.9  4.540    28   129 0.386 1.09  2.79  0.00
E2F1_1 223580  100  31.7  1.010    28   101 0.701 1.29  7.80  2.00
E2F1_2 194919  100  31.8  0.663    28   107 0.303 1.40  5.36  2.79

2.3 质量控制指标摘要

我们来依次看一下exampleExp里面的信息（解读的很粗略，寻求更深理解的可以自行阅读manual）：

• Reads 可以知道bam文件里面有多少reads
• Map% 可以知道bam文件的比对率如何，如上我们可以知道，bam文件是过滤过的，丢弃了为比对上的reads
• Filt% 指的是根据比对质量，过滤的比例
• Dup% 很明显指的是重复率，也是要去除的
• ReadL 读长
• FragL 根据比对情况估算出来的fragment长度
• RelCC 一般大于1，越大越好，大于1可以认为富集的不错
• SSD 同样是富集得分，对高信号值比较敏感，越高越好
• Rip% 在peaks里面的reads占所有reads的比率，一般来说大于5%
• RiBL% 在blacklist region里面的reads占所有reads的比率，可以看出背景的多少，太高了就有问题

2.4 可视化数据

最后的操作很简单：

> ChIPQCreport(exampleExp)
Saving 7 x 7 in image
Saving 7 x 7 in image
Saving 7 x 7 in image
Using Sample as id variables
Saving 7 x 7 in image
Using Sample as id variables
Saving 7 x 7 in image
Saving 7 x 7 in image

异常无脑的操作，在当前工作目录就会出现一个ChIPQCreport文件夹，点开后会有图片以及一个报告html，打开查看即可。

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以下为高通量测序数据处理系列快速通道：

高通量测序数据处理学习记录（零）：NGS分析如何选择合适的参考基因组和注释文件

高通量测序数据处理学习记录（一）：比对软件STAR的使用

高通量测序数据处理学习记录（二）：Read Counts的提取

高通量测序数据处理学习记录（三）：Pathway Analysis及GSEA

高通量测序数据处理学习记录（四）：DeepTools学习笔记

高通量测序数据处理学习记录（五）：上传二代测序数据到GEO

高通量测序数据处理学习记录（六）：什么是测序深度和测序覆盖度？

高通量测序数据处理学习记录（七）：使用ChIPQC包检查ChIP-seq的质量