2019-12-19 学习记录1

binning分箱
Metabat2
Metabat2分箱的步骤：

1. 建索引；2. 比对；3. sam2bam；4. bam2sorted.bam；5. 计算contig深度；6. 分箱；7. 结果。

一、建索引

1.bowtie2-build

使用 bowtie2 的 bowte2-build 功能给测序数据组装得到的 contig 建索引文件，用于比对。

time bowtie2-build -f final.contigs.fa ${infile}.db --threads 16

-f 输入

或者

2.bwa

使用 bwa 给测序数据组装得到的 contig 建索引文件，用于比对。

bwa index -a is final.contigs.fa -p ${infile}.db

一、比对

1.bowtie2

time bowtie2 -1 ALL_READS_1.fastq -2 ALL_READS_2.fastq -p 16 -x ${infile}.db -S ${infile}final.sam

-1 上游序列
-2 下游序列

或者

2.bwa

bwa mem -t 10 -a ${infile}.db 02_removed_host/${infile}/${infile}_paired_clean1.fq 02_removed_host/${infile}/${infile}_paired_clean2.fq  > ${infile}_paired.sam
bwa mem -t 10 -a ${infile}.db 02_removed_host/${infile}/${infile}_single_clean1.fq  > ${infile}_paired.sam
bwa mem -t 10 -a ${infile}.db 02_removed_host/${infile}/${infile}_single_clean2.fq  > ${infile}_paired.sam

三、格式转换：SAM > BAM

使用samtools将sam文件转换成bam文件

time samtools view -@ 16 -b -S ${infile}final.sam -o ${infile}final.bam

四、BAM排序

使用samtools排序bam文件获得sorted.bam文件

time samtools sort -@ 16 -l 9 -O BAM final.bam -o final.sorted.bam

五、计算contig深度

以上一步得到的sorted.bam文件为输入，用Metabat2中自带的jgi_summarize_bam_contig_depths程序计算contig深度。

time jgi_summarize_bam_contig_depths --outputDepth final.depth.txt final.sorted.bam

--outputDepth：输出文件
[final.sorted.bam]：输入文件

六、分箱

1.

time metabat2 -m 1500 -t 16 -i final.contigs.fa -a final.depth.txt -o all -v

-i：contig文件
-a：contig深度

2.

samtools merge ${infile}_merged_sorted.bam ${infile}_sorted_paired.bam ${infile}_sorted_unpaired1.bam ${infile}_sorted_unpaired2.bam

MetaBAT2/metabat/runMetaBat.sh -t 10 03_assembly_megahit/${infile}/final.contigs.fa ${infile}_merged_sorted.bam 
cd ../../

七、分箱结果

分箱其实就是利用核苷酸频率和丰度模式将序列组装得到的contig打包分类的过程，所以分箱结果就是一堆contig的fasta文件如下：

分箱结果.jpg

八、分箱评估

checkm lineage_wf -f checkm.txt -t 4 -x fa final.contigs.fa.metabat-bins10/ checkm/

评估结果保存在checkm.txt文件中。
其中final.contigs.fa.metabat-bins10文件夹中包含了所有的拼接好的fasta文件，checkm中保存着所有的输出结果，-x代表拼接好的基因组序列的后缀

九、合并bin结果

合并所有的bin结果

for file in metabat.*.fa
  do
    num=${file//[!0-9]/}
   sed -e "/^>/ s/$/ ${num}/" metabat.$num.fa >> metabat_binned.concat.fasta
done

生成bin编号注释文件

echo label > metabat_annotation.list
grep ">" metabat_binned.concat.fasta |cut -f2 -d ' '>> metabat_annotation.list

安装MetaBat2

从以下路径下载到最新版本的MetaBat2 https://bitbucket.org/berkeleylab/metabat/downloads/

mkdir metabat2 & cd metabat2  
wget https://bitbucket.org/berkeleylab/metabat/downloads/metabat-static-binary-linux-x64_v2.12.1.tar.gz     
tar -zxvf  metabat-static-binary-linux-x64_v2.12.1.tar.gz

下载后解压即可使用，主程序为runMetaBat.sh
MetaBat2的输入为组装的contig序列以及将二代reads比对到contig序列上的比对文件(bam格式)。比对可以采用BWA或Bowtie2

概念：

宏基因组分箱（Binning）是将宏基因组测序得到的混合了不同生物的序列或序列组装得到的contigs按物种分开归类的过程。传统的单物种全基因组序列都是经纯培养之后，再进行全基因组de novo测序才获得的，但是环境中存在着大量的不可培养微生物，宏基因组分箱技术有助于获得不可培养微生物的全基因组序列，获得新物种的基因组序列和功能，预测未知物种的培养方法等等。
句句干货！一文读懂宏基因组binning
宏基因组实战8. 分箱宏基因组binning, MqaxBin, MetaBin, VizBin
METABAT，一种从复杂微生物群落中精确重建单一基因组的有效工具
宏基因组分析7-binning(Maxbin,metaBAT,CONCOCT)
参考
宏基因组分箱（二）Metabat2分箱实战
宏基因组分箱(Binning)技术
metawrap可视化
宏基因组分箱（四）Blobology可视化Bin
宏基因组分箱（五）Metawrap计算Bin丰度