共识免疫评分应用于结肠癌分类的国际化验证——一项预测和准确性的研究
International validation of the consensus Immunoscore for the classification of colon cancer: a prognostic and accuracy study
摘要/Abstracts
Background The estimation of risk of recurrence for patients with colon carcinoma must be improved. A robust immune score quantification is needed to introduce immune parameters into cancer classification. The aim of the study was to assess the prognostic value of total tumour-infiltrating T-cell counts and cytotoxic tumour-infiltrating T-cells counts with the consensus Immunoscore assay in patients with stage I–III colon cancer.
结肠癌复发风险的评估需要提高。我们需要一个稳健的免疫评分系统来引入免疫参数用于肿瘤的分级。我们的研究目的是评估总肿瘤浸润T细胞数和细胞毒性肿瘤浸润T细胞数的共同免疫评分对I-III期结肠癌的预后价值。
Methods An international consortium of 14 centres in 13 countries, led by the Society for Immunotherapy of Cancer, assessed the Immunoscore assay in patients with TNM stage I–III colon cancer. Patients were randomly assigned to a training set, an internal validation set, or an external validation set. Paraffin sections of the colon tumour and invasive margin from each patient were processed by immunohistochemistry, and the densities of CD3+ and cytotoxic CD8+ T cells in the tumour and in the invasive margin were quantified by digital pathology. An Immunoscore for each patient was derived from the mean of four density percentiles. The primary endpoint was to evaluate the prognostic value of the Immunoscore for time to recurrence, defined as time from surgery to disease recurrence. Stratified multivariable Cox models were used to assess the associations between Immunoscore and outcomes, adjusting for potential confounders. Harrell’s C-statistics was used to assess model performance.
癌症免疫治疗协会对I-III期结肠癌进行免疫评分分析。患者被随机分配到训练集、内部验证集合外验证集。使用结肠癌组织的石蜡切片进行免疫组化试验，通过数字化病理评估CD3+和细胞毒性CD8+阳性T细胞在肿瘤和肿瘤侵袭边缘中的密度。免疫评分是通过四个密度的百分位数平均值获得的。我们主要的重点是评估免疫评分对复发时间的预测价值。使用分层多因素cox模型来评估免疫评分和结局的相关性，调整潜在的混杂因素。通过Harrell’s C-statistics评估模型的表现。
Findings Tissue samples from 3539 patients were processed, and samples from 2681 patients were included in the analyses after quality controls (700 patients in the training set, 636 patients in the internal validation set, and 1345 patients in the external validation set). The Immunoscore assay showed a high level of reproducibility between observers and centres (r=0·97 for colon tumour; r=0·97 for invasive margin; p<0·0001). In the training set, patients with a high Immunoscore had the lowest risk of recurrence at 5 years (14 [8%] patients with a high Immunoscore vs 65 (19%) patients with an intermediate Immunoscore vs 51 (32%) patients with a low Immunoscore; hazard ratio [HR] for high vs low Immunoscore 0·20, 95% CI 0·10–0·38; p<0·0001). The findings were confirmed in the two validation sets (n=1981). In the stratified Cox multivariable analysis, the Immunoscore association with time to recurrence was independent of patient age, sex, T stage, N stage, microsatellite instability, and existing prognostic factors (p<0·0001). Of 1434 patients with stage II cancer, the difference in risk of recurrence at 5 years was significant (HR for high vs low Immunoscore 0·33, 95% CI 0·21–0·52; p<0·0001), including in Cox multivariable analysis (p<0·0001). Immunoscore had the highest relative contribution to the risk of all clinical parameters, including the American Joint Committee on Cancer and Union for International Cancer Control TNM classification system.
经过质控之后，纳入了2681患者进行分析（训练集：700；内验证：636；外验证：1345）。免疫评分分析显示，在训练集中高免疫评分具有最低的5年复发率（14 high，65 intermediate ;51 low; HR for high vs. low：0.2,95%CI(0.1-0.38)）。这些结果也在两个验证集中得到证实。通过患者年龄、性别、T分期，N分期、微卫星不稳定以及已经存在的预后因子的分层Cox多因素分析显示，免疫评分与复发时间是独立预后因素（p<0.0001）。对于II期结肠癌，不同免疫评分的患者5年复发率也是具有显著差异的。免疫评分相对于所有临床参数而言具与预后有最高的相关性。
Introduction
①. 结直肠癌的预后分析目前主要依赖于TNM分期和肿瘤细胞分化；该基于解剖学的方法有用但不能提供完全的预后信息。
②. 新的分类方法基于肿瘤细胞、分子通路、突变状态和肿瘤基因表达等只具有中等程度的准确性。
③. OS、复发与原位的获得性免疫具有密切的相关性。
④. 已经鉴定浸润到肿瘤的免疫细胞亚型，提出假设：浸润免疫细胞组成可能决定这临床结局的好坏。
⑤. 我们已经验证了免疫评分对于预测早期和进展期结直肠癌的预测结局的作用。该一致性免疫评分系统描述了在肿瘤部位和侵袭边缘CD3+和CD8+ T细胞的密度。
⑥. 肿瘤学的一个革命性的改变是通过评估和激活患者已经存在于肿瘤中的免疫系统。而这种肿瘤内的免疫数据可以通过数字病理系统来评估。
⑦. 我们的研究目的就是评估该免疫评分工具对于I-III期结肠癌的临床应用。
Methods
Study design and patients/研究设计和病人
• 随机分配：训练和内验证1:1 +外验证集。
• 通过biomarker quality control 和clinical quality control来排除和纳入样本。
Procedures/步骤
• 采用标准化的操作步骤和分析软件获得CD3+和CD8+ T细胞的密度数据。
• 免疫组化步骤：采用一个蜡块包含结肠癌组织和侵袭边缘。2个4 um的切片；Tris缓冲液抗原修复60 min；CD8抗体37度孵育32 min，CD3抗体37度孵育20 min；DAB染色和Mayer's染色；数字化图像的获得（20X，0.45 um/pixel）。
• 使用数字病理软件获得CD3和CD8的密度。
• 计算两个marker两个区域的密度的均值，然后转化为免疫评分。
• 在三个类别的评分系统中：0-25%——Low；25-70%——intermediate；70-100%——high。
• 如果组织样本足够，提取肿瘤组织和正常场组织，同时通过免疫组化检测MSI的状态。
###Outcomes/结局
• 主要的结局是评估免疫评分对复发时间的预测价值。复发时间是指从手术到复发的时间。次要结局包括DFS和OS。
统计分析
训练集和验证集之间的人口统计学资料和疾病特征分析采用的是Kruskal-Wallis和卡方检验。免疫评分和time-to-event结局之间的双变量关联分析采用的是分层log-rank检验和分层Cox比例风险模型。免疫评分和与结局有关的混杂因素分析采用的是分层多变量Cox模型。模型的表现采用Harrell's C统计分析。免疫评分的准确性评估采用iAUC.
结果
①. 经过质控之后，纳入了2681患者进行分析（训练集：700；内验证：636；外验证：1345）
②. 在训练集中低中高免疫评分的比例分别为：22%，51%和27%。高免疫评分具有最低的复发风险。3年复发风险：高免疫评分：5%；中免疫评分：17%，低免疫评分：26%。对于DFS和OS也有类似的结果。
③. 总生存率，5年的数据是：高免疫评分：82%，中免疫评分：77%，低免疫评分：62%。
④. 这些数据被内验证和外验证集所证实。（具体结果略）
⑤. 接下来分析免疫评分的分析表现（analytical performance），结肠癌部位CD3+细胞的平均密度是693个/mm2，侵袭边缘是1169个/mm2；CD8+细胞的情况则是241和435个/mm2（差异还是比较大的）。
⑥. 通过8个病理专家对5个中心的数据进行重新分析，重复性好（r=0.97）
⑦. 小结：该共识免疫评分定量分析是标准化的、可重复的、稳健的和定量的。
⑧. 在II期结肠癌中（n=1434），高免疫评分也是与低复发风险、高DFS和OS是相关的。
⑨. MSI肿瘤与高的免疫评分是相关的（45%），在MSS肿瘤中，这个数据是27%。
⑩. 高浸润型的肿瘤的免疫评分也是高的。——MSI状态可能诱导一个更强的免疫力。
11. 免疫评分是复发时间、DFS和OS的重要预测因子：C-index:0.74, 0.66, 0.64。
12. 免疫评分预测OS的准确性要比现存的很多风险参数要好：比如分化状态、肿瘤大小、淋巴结转移等。
13. 免疫评分的iAUC值与T分期和N分期是类似的。
14. 将 免疫评分添加到其他临床指标中可以显著提高预测能力。
Discussion
①. 很久以前，人们就还以免疫细胞浸润可能是肿瘤患者结局的阳性因素，但是这对癌症分型和临床决策没有产生重要的影响。
②. 最近的研究阐述了免疫细胞的组合以及新的图像评估软件促进了国际化的免疫评分的验证。
③. 这项研究实符合STARD诊断准确性研究标准的。
④. 严格的染色质量和密度评估保证了不同中心间的同质性和可重复性。
⑤. 通过多重的质量控制，我们的免疫评分定量使可重复的、客观和稳健的。
⑥. 先前已经通过原位杂交免疫反应说明CD3+和CD8的组合提供了最好的预测水平，同时结合肿瘤和侵袭边缘的分析能够更好的预测存活时间。
⑦. 文章也讨论了一些limitation，不同中心患者人群的异质性。
The reproducibility and robustness of the consensus Immunoscore as a strong prognostic factor in association with the TNM classification system favours its implementation as a new component in the classification of cancer, designated TNM-Immune. This would represent the first standardised immune-based assay for the classification of cancer.
该文支持将共识免疫评分与TMN分期相关联，作为肿瘤分期的新的组成部分，成为第一个标准的基于免疫的癌症分类分析方法。
问题：
①. 如何评估免疫细胞的密度？
文中写的是：using a special developed Immunoscore module that was integrated into the image-analysis system of a Developer XD digital pathology software (Definiens, Munich, Gemany).
②. Evidence before this study中提到：有250篇文章，包括杀伤性T细胞、辅助T细胞、记忆T细胞对肿瘤患者预后的影响（涉及28钟不同的癌症类型）。98%的研究显示CD8+浸润肿瘤与较好的预后相关。其中，结肠癌是研究得最多的肿瘤类型。
……
Ref：Pagès F, Mlecnik B, Marliot F, et al. International validation of the consensus Immunoscore for the classification of colon cancer: a prognostic and accuracy study. Lancet. 2018 May 26;391(10135):2128-2139.