“高兰”习武之“道”--—— 猪病“小兰”的时空之旅【连载-8】

TIPs:

HP-PRRSV表现出更强的体内外增殖能力

HP-PRRSV以 nsp2基因内30个不连续氨基酸缺失与致病性无关

HP-PRRSV nsp9（RdRP）和nsp10（解旋酶）与其致死性毒力相关

HP-PRRSV一出，其他病毒都成了“将就”。“高兰”毒株武功高强，其感染往往表现出严重的临床表现（如更高的体温反应，更猛的发病进程，更令人痛心的死亡率和更惨的继发感染）；更显著的病理变化（更多的肺泡内细胞浸润，更急的肺脏损伤，更明显的肺泡纤维化和更多的胸腺细胞凋亡）；更猛的复制态势（更高的病毒血症滴度，更广泛的抗原分布和更早刺激机体抗体转阳）以及更剧烈的免疫反应（更强的炎症反应以及更严重的免疫抑制）。但，HP-PRRSV毒株致病性升高的真正原因是什么呢？在多年的演化过程中，HP-PRRSV因为哪些变异习得了如此了得的武功？

【为何要做分子基础】

兵法曰，知己知彼，百战不殆。鉴定病原微生物的毒力因子（Virulencefactor）是了解“对手”的重要步骤，知道其厉害所在，更加便于监测、分型和提防。此外还与疫苗开发息息相关，最直接的例子就是伪狂犬病病毒PRV，当发现其gE基因与致病性（噬神经性）相关，同时还可以缺失之后不影响病毒存活性和能够刺激机体保护的免疫原性，一个免疫后可鉴别野毒感染和疫苗免疫的的标记疫苗就此应运而生了。但可惜是PRRSV并没有这般容易。

【怎样做分子基础】

为了分析找到高致病性毒株致病性改变的分子基础，学界其实找了两种模型，二者都是在病毒的变化中发掘其暴露的信息，再用改造病毒的方法去验证。一种是用病毒传代致弱模型，去分析病毒亲本毒与病毒细胞传代致弱毒之间的序列差异，寻找其基因变异与病毒致病性降低的相关性，打个便于理解的比喻，就好比一辆车，开个二三十万公里后，零件老化，速度跑不起来了，你找量同款新车过来互换零件，找出老化的毛病。该模型更多的是研究病毒在细胞传代适应过程中的哪些突变引起其在宿主动物中的不适应，导致致病性下降。另外一种模型，是我们戏称的双奥模型（奥迪vs 奥拓），如果把HP-PRRSV比作奥迪，LP-PRRSV看作奥拓，来分析为何奥迪为何比奥拓开的开得快，是豪华的内饰，还是外形的风阻，是强劲的发动机，还是车头的logo及LED的车灯？由于咱BossYang多年前就一直从事PRRSV研究，在HP-PRRSV暴发前分离到一株跟HP-PRRSV亲缘性97.4%的经典弱毒株（无致死性），为分子致病性的研究提供了一个难得的模型。

当高热刚发，HP-PRRSV最标志性的分子marker就是nsp2里面那30-aa的缺失，所以大家不约而同的都猜测这会不会是病毒致病性升高的原因，为了证实该缺失与致病性的相关性，我们利用反向遗传学操作平台（感染性克隆技术）分别构建HP-和LP - 毒株的全长质粒，然后把低致病性的nsp2缺了30个氨基酸，同时把高致病性的缺失区域用低致病性毒株的序列补齐，然后拯救病毒，做动物实验，发现嵌合毒株死亡率等致病性指标跟骨架毒基本没啥变化，证实了nsp2的30aa缺失跟病毒致病性无关，后面致弱疫苗出来发现还是带有这缺失，也证实了我们的结果。“高兰”肯定心中暗喜，你大爷还是大爷，想废了我没那么容易。

这不相干，那与谁相关呢？不死心啊，后面的工作就是换换换，做各种马赛克嵌合病毒，从ORF1a，ORF1b和结构蛋白的大片段换到ORF1b里面各种单换与组合换，最后到nsp9（RNA聚合酶RdRp） 和 nsp10（解旋酶）(见下图详解），这两个酶都与病毒的复制转录中RNA的合成息息相关，一句话就是奥迪车的V8发动机和豪华变速箱。把它俩从高致病毒株上拿到LP-PRRSV上，嵌合毒立马体内外复制增强，攻毒致死猪（致死率和存活曲线见下图）。

再后面的深入挖掘就是找与毒力相关的突变位点，这就好比分析影响发动机效率的一个活塞，一个喷油嘴和一个螺丝，难度更大。我们评价了多个HP-PRRSV相对LP-PRRSV共有突变点对病毒增殖和致病性的贡献，这信息等文章修回接收之后有机会再表。

【分子机制是什么】

PRRSV致病性增强的机制（逻辑）是什么？“单兵强大”还是“群狼战术”？

‍第一条逻辑链：HP-PRRSV“单兵力量就是大”如图中俄罗斯阿姨，单独拿出两个病毒来看HP就是能够导致免疫抑制能力更强、先天性免疫激活能力和拮抗能力有差异，能引起胸腺细胞凋亡（胸腺萎缩），能下调Th17辅助T细胞，能够激活TNF-a，能够上下调一些与致病损伤的宿主蛋白。----个体能力效应差异。

第二条逻辑链是：HP-PRRSV“军队士兵多”。HP-PRRSV针对06年以前的经典毒株，nsp9和nsp10获得一定突变，使其在靶细胞以及体内增殖复制能力增强，病毒产生数量增多，单兵能力差异不大，但数量累积效应大，PAM损伤加大，表现更严重的炎性反应，（高温，急性肺损伤），更强的免疫抑制。一句话“敌人”人多势众。但问题是，nsp9和nsp10的突变是如何改变病毒增殖能力的？是RNA合成效率的增加，还是突变之后改变了与宿主内一些宿主蛋白的相互作用，能够找到宿主蛋白的帮忙还是能够逃逸宿主限制性因子的激活和作用？还是只是RNA一级结构的改变，影响了这两个蛋白的翻译能力使酶数量多了，转录RNA效率高了。---群体数量效应差异。

由于病毒一直都是以群体在发挥作用，似乎两条逻辑链，相互缠绕，很难割舍。欲知其意，实为不易，只能说PRRSV分子致病机制研究，未完待续……

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