ToneScript cDNA 第一链合成试剂盒常见问题

ToneScript cDNA第一链合成试剂盒是专门用于两步法RT-PCR的第一步，含有合成高质量第一链cDNA所需的所有成分，适用于后续的PCR、qPCR以及基因克隆。那么在实际操作中会有哪些常见问题呢？一起来了解一下：

1、 没有RT-PCR产物或产量低

◆RNA模板降解。RNA的纯度和完整对于反转录得到全长cDNA是非常重要的。提取的RNA应进行电泳检测以确定其是否降解。同时RNA要避免多次反复冻融。

◆RNA模板纯度低。提取RNA的过程中，可能残留一些盐离子、试剂，如EDTA、酚、胍盐、磷酸盐、多胺等抑制接下来的反转录反应。建议用75%乙醇（DEPC水配制）仔细清洗RNA沉淀。

◆引物不合适。选择合适的引物，当RNA是细菌RNA或者是没有polyA尾的RNA要选择随机引物或者特异引物。

◆目的基因含有复杂二级结构或高GC含量。建议选择随机引物进行反转录。将反转录温度提高至55℃。

2、RT-PCR产物比预期长

◆RNA中很可能污染了DNA。真核生物基因组DNA中含有内含子，可能参与了PCR扩增，可以在反转录之前对RNA进行DNaseI的消化。

3、阴性对照中有RT-PCR产物

◆阴性对照中有RT-PCR产物也表明有DNA的污染。在反转录之前对RNA进行DNase I的消化。