TIPs：
1，望闻问切，探嫌疑；
2，临床剖检，定方向；
3，核酸检测，来探底；
4，血清学里，寻痕迹。
临床病例接触的越多，越觉得疫病的诊断就像破案，在信息收集整理过程中，不断逻辑推演，假设“凶手”、验证或排除，然后发现蛛丝马迹，产生预判，夯实证据，确定“真凶”，复盘推演，说服自己或说服别人。有时候也有可能只是能够确认排除谁谁谁的嫌疑，真凶逍遥……让人突然想起这活很像以前老妈追过的TVB神剧《鉴证实录》里那个Dr Nie干的。没有诊断的疫病控制就像高速路上的闭眼驾驶，蒙眼狂奔，出不出事故只能听天由命。那今天就来唠一唠，蓝耳的诊断。
【背景信息收集】
中医讲望闻问切，流行病学讲究信息收集与分析，往往能找到重要怀疑对象。发病时间、发病比例，死亡率，发病日龄，发病群体，先后顺序，疫苗免疫情况，是否有引种，是否有后备猪并群，是外来猪先发病还是本场母猪先发病？是否有买卖拉猪，是否有换料换苗或者天气异动等等都可能对诊断带来启示。--鱼骨法归因分析
【临床诊断/现场预判】
前面第5期的时候说过PRRS临床症状主要表现为母猪的繁殖障碍和生长猪的呼吸道疾病，可分为：急性型、慢性型、亚临床型以及由HP-PRRSV引起的严重型（或非典型性）PRRS。而且随着疫苗的使用以及HP-PRRS的持续变异，毒株的毒力已经有所下降，所以即使在阴性猪场暴发，在现场也很难看到2006-2007年那样的景象。毒株间致病性具有差异，加之PRRSV往往与其他病毒和细菌混合感染，或PRRSV免疫抑制，继发细菌感染。这些导致了最要命的事，“猪群状态不同，临床表现差异较大”，大大增加了蓝耳的诊断难度。所以临床诊断基本不叫诊断，只能叫预判。那我们来说说常见的线索。
大部分情况在猪场怀疑出现蓝耳，多是因为发生母猪群连续出现繁殖障碍如流产，早产和死胎，母猪流产率可达30%以上。很多流产母猪有会在流产前后出现厌食（不吃料）和发烧（烧到40-41度），但也有毫无征兆的。母猪群返情率增加，配种成功率下降。若毒株比较生猛，母猪也有可能出现咳喘等呼吸道症状。公猪感染除了表现呼吸道症状外，可表现性欲缺乏和不同程度的精液质量降低。
也有从保育和育肥初期开始发的，猪群主要表现出精神沉郁对饲养员爱答不理，不爱吃料，爱扎堆（发烧畏寒，抱团取暖），眼睑水肿，结膜炎（眼角分泌物增多），有的能出现耳朵发绀(耳朵变蓝）有的可能出现神经症状。发病后期的猪，消瘦，被毛粗乱，有的由于继发感染严重出现腹式呼吸和关节肿胀，跛行。
保育和育肥期发病猪剖检后最明显的病变在肺脏，呈肝样肉变，多见于肺部尖叶、心叶和膈叶的近心端，间质增宽，用手按上去手感变硬，不塌陷。
下颌淋巴结、肺门淋巴结和腹股沟淋巴结水肿，出血或充血。日龄比较低的猪可以观察到胸腺萎缩。早期HP-PRRSV分离株攻毒感染的时候，还能见到肾脏表面和肾盂区、心冠脂肪区、膀胱、胃底和肠道以及脑的点状出血。若病程较长由于副猪嗜血杆菌和传胸感染，可见心包积液，纤维素样渗出（绒毛心）胸腔内脏器黏连和腹膜黏连。
【采样送检】
如果是母猪群发病，我们通常每窝收集流产胎儿（2-3头），加上流产母猪血清。如果是仔猪发病，则选取发病初期的动物个体至少三头以上，先采血再剖检，主要采集肺脏淋巴结，血清与病料同时送检。我们系统的做过不同毒株在肺脏、胸腺、扁桃体和几个重要淋巴结的病毒分布情况，选取肺脏和扁桃体和腹股沟淋巴结，病毒数量肯定是有保障的，鉴于文章未发，先不贴图了。送样过程中，冷链（干冰>冰袋 >啥都没有）保存非常重要，有条件的分离血清后再送检比全血更好（避免运输中溶血影响检测）。
【实验室病原检测】
理论上病毒分离、免疫组化（IHC）、免疫荧光（IFA）、探针原位杂交、普通RT-PCR，巢式RT-PCR和RealtimeRT-PCR，当然还有导弹打苍蝇不切实际的高大上方法深度测序（deep sequencing） 和基因芯片（DNA chips），以及目前还不靠谱的恒温扩增（RT-LAMP）都可以鉴定PRRSV病原。但国内最接地气的还是RT-PCR和Realtime PCR。
PCR优点：便宜（仪器投入低，试剂相对便宜），PCR产物可以直接测序，有图（条带）有真相，报告直观，可根据片段（nsp2）大小判断属于何种类型毒株；缺点：不能精确定量，敏感性不如RealtimePCR，PCR产物需要开盖跑胶步骤繁琐，产物中目的片段拷贝数极高，容易污染检测体系。
Realtime PCR优点：敏感性更强，可根据Ct值初步判断数量级，建标准曲线可精确定量，不用开盖跑胶，省事，减少污染风险。炫富炫技体现检测者有钱高大上。缺点：贵，一般目标片段较小，不方便直接测序，太敏感更容易污染。没有电泳图，Ct值跟核酸模板量成反比，比较不直观。
<靶标基因选择>
最常扩增的是nsp2 高变区，ORF5（GP5蛋白编码区）和 ORF7（N蛋白编码区）三个片段各有特征。nsp2是和ORF5是PRRSV基因组变异最大的地方，对这两个地方的扩增主要是方便进一步的测序和遗传演化分析。最早HP-高兰刚出的时候nsp2区的30aa缺失（90nt）是其分子标致，可以用于区分经典毒和HP-PRRSV，但随着HP-PRRSV来源的致弱活疫苗（MLV）的使用，这个标致立马失效了，现在趋于把其叫做HP-PRRSV-likevirus。此外 131aa的缺失是lineage 1 NADC30-like的分子标志，120aa的缺失是TJM-F92以及其演化毒的分子标致。ORF5 可以用来测序进行lineage（谱系）归类，在美国还可以配合酶切图谱分析用来毒株归类（比如1-7-4，1-8-4等）。但是由于各种重组的出现，现在不分毒测全序，根本不知道这个病毒到底属于什么，有可能nsp2是HP的，ORF5却是NADC30-lIke的。
ORF7才是诊断（证明有无)最好的靶标。原因如下，第一ORF7在毒株间保守，引物不容易因为病毒突变漏检；第二ORF7量足。因为PRRSV病毒属于巢式病毒目，病毒数（基因组数量）一定的情况下，越靠近ORF7，转录的拷贝数越多，这也是为什么有时送检样品ORF7扩得出来，但ORF5条带亮度一般，nsp2 根本检不到的原因。
<病毒分离>
病毒分离的成功与否有很多限制因素，比如发病动物的选择（刚发病具有典型症状的），取材脏器的选择（肺脏和淋巴结），病变部位（健康与病变交界处），组织保存和运输（新鲜，冷链），分毒用细胞种类和状态，前面是尽人事，后面还有一条听天命的就是病毒在组织中的载量和病毒的增殖特性。病毒分离后可以经细胞病变（CPE）看到，再用间接免疫荧光（IFA）、PCR和测序进行确证。
<血清学方法>
对于阴性猪群，因为不免疫，只要检测到特异性抗体便是发生了感染，所以ELISA和IFA抗体检测的方法就可以确诊。但实操做需要注意的是，按ISUVDL（爱荷华州立大学兽医诊断实验室)的观点，对于阴性猪群，S/P=0.4的 标准cut off值应该下调致0.2或者0.1，这样能够跟早的看到异动，及早发现问题，及早处理。国内一些知名集团的阴性群也是这样操作的。
对于阳性猪群，单纯的S/P值就不能说明问题，有的将2.0以上归为野毒感染，2.0以下是疫苗免疫是没有太多科学依据的。由于猪只的个体差异，接触病毒的时间不同，和毒株的差异都可导致S/P的不一样，比如处于强毒感染的早期S/P就有低于2.0的时候，这是经验性的2.0基线判断恐怕就要吃亏了。也有从业者提出如果在固定疫苗,免疫程序和生产管理模式以及监测方法的情况下可以通过定期抽查一定比例猪群的抗体水平，绘制自己猪群的基准线，当抗体S/P值发生异动的预警感染和疫病的发生。这是一个宏观的监测概念，但总还是有漏检和个体差异的问题无法解决。传染病诊断中有个血清学的利器是叫做“双血清法”在间隔一定时间的情况下，对单一动物进行两次抗体检测，从抗体的波动，可以推测感染情况。前期说过PRRSV感染后7天可检测到IgG，所以对同一动物间隔7-10天的抗体检测有与比较可以精确知道感染情况。这里先提个理想，如果可以理想化的做到每头核心群的猪都定期监测抗体水平，记录单一个体的S/P值，那抗体异动以及个体感染就很容易被发现了。我猜金诺和IDEXX的同学看到这句话应该会疯狂点赞，拼命打赏呵呵。。。
时间不早，也码了太多文字，这次只讲诊断的基本原则，关于猪群监测 ，实验室操作的一些注意事项以及PRRS所处状态的评估以后再说。
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