HE染色太简单？精良之作自带高级感

HE染色

HE染色即苏木精－伊红染色法( hematoxylin-eosin staining )，是石蜡切片技术里常用的染色法之一。苏木精染液为碱性，主要使细胞核内的染色质与胞质内的核糖体着紫蓝色；伊红为酸性染料，主要使细胞质和细胞外基质中的成分着红色。

一张做工精良的HE切片是病理医生得以做出正确诊断的关键。HE染色是目前国内外病理诊断上广泛采用的 常规染色方法。切片质量的好坏，可直接影响疾病诊断的及时与准确性。因此，能制作出一张高质量的HE染色切片，是必须掌握的技术之一。

染色原理

1、细胞核染色原理

苏木精为碱性天然染料，可使细胞核着色。细胞核内染色质的成分主要是DNA，在DNA的双螺旋结构中，两条核苷酸链上的磷酸基向外，使DNA双螺旋的外侧带负电荷，呈酸性，很容易与带正电荷的苏木精碱性燃料以离子键或氢键结合而被染色。苏木精在碱性溶液中呈蓝色，所以细胞核被染成蓝色。

2、细胞浆染色原理

细胞浆内主要成分是蛋白质，为两性化合物、细胞浆的染色与pH值有密切关系，当pH调到蛋白质等电点4.7-5.0时，胞浆对外不显电性，此时酸或碱性染料不易染色。当pH调到6.7-6.8时，大于蛋白质的等电点pH值，表现酸性电离，而带负电荷的阴离子，可被带正电荷的染料染色，现时胞核也被染色，核和胞浆难以区分。因此必须把pH调至胞浆等电点以下，在染液中加入醋酸使胞浆带正电荷（阳离子），就可被带负电荷（阴离子）的染料染色。伊红Y是一种化学合成的酸性染料，在水中离解成带负电荷的阴离子，与蛋白质的氨基正电荷（阳离子）结合而使细胞浆染色，细胞浆、红细胞、肌肉、结缔组织，嗜伊红颗料等被感染成不同程度的红色或粉红色，与蓝色的细胞核形成鲜明的对比。

3、分化作用

染色后，用某些特定的溶液将组织过多结合的染色剂脱去，这个过程称为分化作用，所用的溶液称为分化液。在HE染色中用0.5%盐酸乙醇作为分化液，因酸能破坏苏木精的醌型结构，使组织与色素分离而褪色。经苏木精染色后，必须用0.5%盐酸乙醇分化，使细胞核过多结合的苏木精染料和细胞浆吸附的苏木精染料脱去，在进行伊红染色，才能保证细胞核与细胞浆染色的分明。因此，在HE染色中分化是极为关键的一步。

4、返蓝作用

分化之后，苏木精在酸性条件下处于红色离子状态，呈红色，在碱性条件下处于蓝色离子状态，呈蓝色。组织切片经0.5%盐酸乙醇分化后呈红色或粉红色，故分化之后，立即用水除去组织切片上的酸而终止分化，再用弱碱性水（0.2%氨水）使苏木精染上的细胞核呈现蓝色，这个过程称为返蓝作用或蓝化作用。另外用自来水浸洗也可使细胞核返蓝，但所需时间较长。

染色步骤

——固定液：常用95%乙醇和冰丙酮

——苏木精染液：称取苏木精粉0.5g，铵矾24g溶解于70ml蒸馏水中，然后取NaIO 31g，水5ml，再加入甘油30ml和冰醋酸2ml，混合均匀，滤纸过滤，备用。

——伊红染液：称取0.5g水溶性伊红染液，溶于100ml蒸馏水中。

——稀盐酸乙醇溶液：用75%乙醇配制1%盐酸。

——系列浓度的乙醇、二甲苯、中性树胶。

1.样品制备

对于贴壁生长细胞，胰酶消化，调整细胞浓度约1×105/ml，滴加于盖玻片上(置于6孔板中)，培养相应时间后，取出细胞爬片，用PBS 洗涤3次。

2.样品固定

95%乙醇固定20min，PBS洗涤2次，每次1min。

3.染核

苏木素染液染色2-3min，自来水洗涤。

4.分色

镜下观察，若细胞核染色过深，用1%盐酸酒精溶液分色数秒，自来水洗涤。

5.染胞质

浸入伊红染液染色1min，自来水洗涤。

6.封片

吹干或自然晾干细胞 爬片后，中性树胶封片。

注意事项

一、pH值的调节

如果组织块在福尔马林中固定时间长，组织酸化而影响细胞核着色。因此，要在自来水中冲洗时间长一些或在饱和碳酸锂水溶液中处理10-30min，这样可以使细胞核着色较深。染伊红时胞浆着色不佳，可在伊红溶液中滴加1-2滴冰醋酸。

二、分色时间的控制

分色这一步是关键，应在显微镜下控制进行，一般以细胞核染色清楚（晰）而细胞质基本无色为佳。如果过分延长分色时间将导致染色太浅，应重新染色后再行分色。

三、酒精脱水应彻底

切片经酒精脱水后，入二甲苯时可出现白色不透明状态，此为脱水不彻底，应将切片退回无水酒精，更换酒精、二甲苯，以求彻底脱水与透明。 切片从二甲苯取出或进入二甲苯前，切片周边均应擦干净或吸干多余水分。

四、避免切片干燥

在染色过程中不要让切片干燥，以免切片收缩、变形，影响神经元形态。

五、避免切片污染

出现切片污染，污染物遮盖该部位的细胞或组织难以观察期形态改变。应定期过滤各种染液和试剂以避免其中的沉淀物所引起的污染。

六、避免脱蜡不完全

冬季室温低时（14℃以下），二甲苯应在水浴缸中适当加温到30℃后再脱蜡，以避免因脱蜡不完全引起的染色不均匀呈雾化状态。

七、封片注意事项

最后封固时，要用中性树脂，防止日后褪色，盖片要选大于组织块的面积，如漏出一部分不久将会褪色，所用树脂浓度要适当，树脂封固时不能有气泡。