CRISPR-Cas9基因敲除实验步骤 Month 4 --可能的收官之帖(但还远未结束)

我的CRISPR-Cas9基因敲除系列实验推文好久没更新了,中间遇到了不少问题,好在都算是一一解决了,细胞在今天早上也已经送出去做测序验证了,希望能有比较好的结果。今天将会把我整个CRISPR-Cas9实验的过程以及思路放在这里。

--Part 1 开始前的碎碎念

我从2月28号开始正式做CRISPR-Cas9基因敲除实验,并不包括前期的sgRNA设计以及引物等待的时间,且本实验室已有前人构建了较为成熟的CRISPR-Cas9基因编辑系统,因此相关的试剂和耗材没有耗费我太多的精力,个人认为这一点是非常重要的。对于我而言,这4到5个月的时间是对CRISPR-Cas9从零开始,边做边学的一个死磕的过程。很多时候是箭在弦上,不得不发。以下是我遇到的困难总结:
1. 缺乏所有的相关背景知识:这一点在我看张峰老师组的文章的时候,最为明显。因此花了大量的时间查看中英文文献以及推文,甚至自己也在总结写推,即使是这样,随着实验的推进,不知道的东西越来越多,只能兵来将挡水来土掩,这个背景知识的学习过程,任何人都无法代替且非常重要,因为缺乏背景知识,就算有师兄指导,自己也不能很好的吸收。
2. 对整个分子克隆系统的不熟悉:在这之前我从未做过分子克隆相关实验,例如:载体构建,酶切实验,质粒转化、扩增和提取,更别说相关的背景知识了。因此又补充了质粒结构,golden gate还有Gibson assembly等相关知识。可以说在这4个月期间我做得最多的一套操作就是。基因组DNA/质粒提取或者扩增--PCR--切胶回收--酶切跑胶--再次切胶回收--assembly--感受态转化--挑单克隆扩增--质粒提取,酶切验证等等。这一系列实验花费了大量的精力并且大幅占据了实验记录本(因为我不仅仅是只做CRISPR-Cas9简单敲除,还在学习其他基因编辑方法)。
3. 对基因编辑系统的理解:一开始是看张峰老师组的文章,但是各个实验室在某些步骤上都有自己的偏好和概统。因此当我结束上一个实验,准备进入下一步的实验的实验,师兄说我们不这么做,我们做XXX,然后就懵了。刚开始的感觉就是,当天到底做啥都是在做之前几个小时或者提前一天才知道,真正的箭在弦上,不得不发。更换实验步骤和方法,意味着我预先准备的试剂耗材或者说是protocol是用不着的,需要紧急熟悉新的protocol,而且protocol还需要师兄过目(这一点就是有人指导的好处),并且点好关键步骤之后才能往下做。

解决困难的办法:
1. 不抗拒,享受补充背景知识的过程。在这里非常感谢导师能给予非常大的耐心,也感谢师兄给予的指导,虽然他们都看不到我的推啦~先看中文快速熟悉后再看英文,效果会更好。
张峰老师组的文章还有addgene上的poster或者小推文,非常的重要,必学!必要时还可以结合视频进行理解
2. 厚脸皮,就算被人家说怎么啥也不懂,也不要有心理压力,毕竟这是真的。有问题查了资料不能解决就问,问到了就好好学,转化为自己的知识就够了。今天中午吃饭的时候带我的师兄第一次夸了我,说你整理得挺清楚的(我今天大汇报),真是激动一脸,感谢师兄DZ。
3. 所有可以用到的资源一个都不放过,因此在早期的时候,果子老师,还有我好友铁丝、喜糖、大锅头等都是被我常常骚扰的,常常大晚上给人家留言问问题,而他们则显示出了优秀学者严谨、细致又认真的习惯和风度,从不同角度给了我指导。不仅是背景知识,甚至在我烦躁的时候还会有一点心理按摩,在大方向上也会给我点明,让我少走了不少弯路。得嘞,欠你们螺蛳粉了。

--Part 2 正文开始

背景知识准备

  1. 参考文献
    (1)张峰老师组最全面的CRISPR/Cas9 protocol (我的前期推文已有相应解读):
    Genome-scale CRISPR-Cas9 knockout and transcriptional activation screening
    (2)Addgene网站相关poster和推文
    (3)中文推文

  2. 试剂耗材准备
    (1)细胞:293T工具细胞,目的细胞,DH5α、stal3感受态细胞(可自行制备,详见附件protocol)
    (2)试剂盒:质粒小提、基因组DNA提取试剂盒,胶回收试剂盒--均来自天根生物
    (3)试剂:X-tremeGENE HP DNA Transfection Reagent-Roche (推荐),lipofectamine 3000 (life 公司),CloneR,ROCK inhibitor(干细胞相关需要)
    (4)质粒准备:常用Cas9-puro质粒
    (5)限制性内切酶:实验室常用限制性内切酶,Golden gate assembly、Gibson assembly相关酶
    (6)仪器准备:流式分选,IncuCyte活细胞工作站
    (7)软件准备:Snapgene

流程及目录

  1. 确定要敲除的目的基因
  2. sgRNA设计(详见文末我的sgRNA设计推文,该推文同时包含PCR引物设计流程),并交由公司合成;需要同时提交PCR引物订单(见附件protocol-1)
  3. 将sgRNA克隆至Cas9-puro质粒中,并使用酶切验证(见附件protocol-2,3)
    (1)在BbsI酶的作用下,使用golden gate方法将sgRNA克隆到Cas9质粒;
    (2)将连接产物转化感受态细胞,涂平板,过夜培养12-16小时;
    (3)挑取单克隆扩增12-16小时;
    (4)质粒提取后酶切并琼脂糖凝胶电泳验证。
  4. 将Cas9-puro-gene质粒转染至293T细胞(24孔板即可),48/72小时后达到>70 %转染效率
    (1)基因组DNA提取;
    (2)Q5 PCR(这里的Q5是指NEB公司的高保真DNA聚合酶,详见附件protocol-4)
    (3)凝胶电泳Q5PCR产物,并将目的基因条带切下,胶回收试剂盒提取DNA条带(详见胶回收试剂盒说明书,未附上,需要根据实验室试剂盒查找)
    (4)NEB公司T7 Endonuclease I 酶切验证是否有基因突变(详见附件protocol-5)
    (5)验证结果OK后进行正式实验
  1. 将Cas9-puro-gene质粒转染至目的细胞(普通细胞或肿瘤细胞使用Roche公司转染试剂集合,干细胞等难转细胞需要使用特殊试剂或者电转),参照各转染试剂说明书即可

  2. 根据转染效率进行筛选:>70 %,直接种96孔板进行单克隆培养(每个孔只种一颗细胞,注意,需要实时拍照观察)

    如转染效率非常低,可使用FACS富集后,再进行单克隆培养,大约1-2周后,单克隆成团,将单克隆细胞移至24孔-6孔板扩增。

  1. western blot验证敲除效率
    (1)使用说明书推荐的阳性细胞验证抗体
    (2)WB检测目的细胞蛋白表达
    (3)蛋白表达量太低无法识别时使用免疫荧光检查
    (4)需要注意一些蛋白是在特殊刺激下才有表达,需要预处理方可验证到,请提前看好文献

  2. 验证成功后
    (1)基因组DNA提取
    (2)Taq PCR扩增目的条带,胶回收试剂盒回收目的DNA
    (3)目的DNA连接T载体,转化至感受态细胞,涂平板过夜培养
    (4)挑选单克隆、扩增,菌液PCR验证
    (5)提取质粒,送公司测序

  3. 最终结果查看

--Part 3 葫芦

昨晚回去想了想,觉得网络上详细的实验步骤不是没有,各种学习教程比比皆是,但是零基础初识CRISPR-Cas9的人怎么样才能做下来一个实验。因此,我的教程必须是可以使得零基础的人跟随着步骤,结合自己搜索的实验protocol,一步一步做下来。而去哪里获取合适的protocol呢?试剂公司的说明书永远是最好的,在这一整条流程中,各种质粒提取,转化酶切,都可以查阅到相关说明书,例如:

  1. 感受态细胞的制备可以简单的查一查卖这个试剂盒的公司的说明书
  2. 质粒转化,可以查阅感受态细胞的说明书
  3. 质粒提取,胶回收都有相应试剂盒
  4. 酶切、Q5/Taq PCR、质粒转染全部都有说明书可循

综上所述,你差的不是protocol,而是依样画葫芦的葫芦,而这个葫芦就是前人的经验,我没办法在这里放太多东西,但是我可以把我每一个关键步骤的结果模拟图附上。根据课题保密需求,只有部分无关紧要内容从我的汇报PPT中拿出来,其余结果图均从网上获取整合后以供参考。

实验1-4 前期准备及预实验


CRISPR-Cas9基因敲除实验步骤 Month 4 --可能的收官之帖(但还远未结束)_第1张图片
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实验 5-6


CRISPR-Cas9基因敲除实验步骤 Month 4 --可能的收官之帖(但还远未结束)_第2张图片
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实验 7-9


CRISPR-Cas9基因敲除实验步骤 Month 4 --可能的收官之帖(但还远未结束)_第3张图片
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望成功

--Part 4 照例放一下前期的推文链接

基础知识系列链接(节选):

CRISPR-Cas9学习笔记
Cre-LoxP条件性基因编辑系统--学习笔记
FLP-FRT系统--诱导性基因编辑inducible gene editing

系列实验链接:

CRISPR-Cas9基因敲除sgRNA设计
CRISPR-Cas9(三)--sgRNA设计好之后
CRISPR-Cas9基因敲除实验步骤 day 1
CRISPR-Cas9基因敲除实验步骤 day 2
CRISPR-Cas9基因敲除实验步骤 day 3
CRISPR-Cas9基因敲除实验步骤 day 4
CRISPR-Cas9基因敲除实验步骤 day 5-15 转染验证
CRISPR-Cas9基因敲除实验步骤 day 18 转染后验证
CRISPR-Cas9基因敲除实验步骤 day 25? 正式实验

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