cufflinks使用-2 (2018-05-29)

更多请了解Cufflinks:  http://cole-trapnell-lab.github.io/cufflinks/

图片来自上面的网址，cufflink workflow

Cufflinks 利用Tophat比对的结果（alignments）来组装转录本，估计这些转录本的丰度，并且检测样本间的差异表达及可变剪接。

这个软件其实是个套装，包括四个部分分别命名为：cufflinks、cuffcompare、cuffmerge及cuffdiff.

流程：

第一步，利用tophat/bowtie比对结果（bam格式）及参考基因组构建转录本，最终的转录本是以gtf格式保存的。

第二步，Cuffcompare主要是对两个或多个转录本集合中转录本相似情况的比较，例如将第一步构建出的转录本与ENSEMBL数据库中的转录本进行比较，评估转录本构建情况，此外，根据构建的转录本与已知ENSEMBL数据库中的转录本的相对位置定义了一系列分类，例如内含子区域、反义、基因间区域转录本等等近10种分类。

第三步，cuffmerge是将多个转录本集合合并成一套转录本集合，例如将在多个组织样本中构建的多套转录本合并成一套转录本，cuffmerge能够很好地完成去除冗余。

第四步，cuffdiff衡量两个或多个样本间差异表达的基因，例如癌症与正常组织间差异表达的转录本，此外还能衡量差异可变剪接体。

至此，转录本测序常规数据分析基本结束，接下来进行实验验证或深入数据分析。

具体实例：

Mapping完了以后，cufflinks就可以把map到基因组里的序列组装成一个转录组了，这个转录组理论上包含了所有当时细胞里的所有mRNA，组装好的转录组包含了可能的剪切信息和所有转录的表达量，这个表达量是根据map到基因组的序列的总数和每个转录片断的长度进行归一化的，听起来比较难懂，它是对于在转录片断里的每一千个碱基对，在每一百万个成功map的序列中，map在这一千个碱基对上的序列的比例，

fragments per kilobase of transcript per million mapped fragments (FKPM)。

参考生信菜鸟团：http://www.bio-info-trainee.com/166.html

详细使用参照：http://blog.sina.com.cn/s/blog_751bd9440102v72b.html

[   Cufflinks输出结果

cufflinks的输入文件是sam或bam格式。并且sam或bam格式的文件必须排好序。（The SAM file supplied to Cufflinksmustbe sorted by          reference position.）Tophat的输出结果sam或bam已经排好了序。针对其他的未排序的sam或bam文件采用如下排序方式：

sort -k 3,3 -k 4,4n hits.sam > hits.sam.sorted

1. transcripts.gtf

该文件包含Cufflinks的组装结果isoforms。前7列为标准的GTF格式，最后一列为attributes。其每一列的意义：

列数  列的名称  例子        描述

1    序列名    chrX        染色体或contig名; 2    来源      Cufflinks  产生该文件的程序名; 3    类型      exon        记录的类型，一般是transcript或exon; 4    起始      1          1-base的值; 5    结束      1000        结束位置; 6    得分      1000        ; 7    链        +          Cufflinks猜测isoform来自参考序列的那一条链，一般是'+','-'或'.';8    frame    .          Cufflinks不去预测起始或终止密码子框的位置; 9    attributes  ...      详见下

每一个GTF记录包含如下attributes：

Attribute      例子      描述

gene_idCUFF.1Cufflinks的gene id;transcript_idCUFF.1.1  Cufflinks的转录子 id; FPKM          101.267  isoform水平上的丰度,FragmentsPerKilobase of exon model perMillion mapped fragments; frac          0.7647    保留着的一项，忽略即可，以后可能会取消这个;conf_lo        0.07      isoform丰度的95%置信区间的下边界，即 下边界值 = FPKM * ( 1.0 - conf_lo );conf_hi        0.1102    isoform丰度的95%置信区间的上边界，即 上边界值 = FPKM * ( 1.0 + conf_hi ); cov            100.765 计算整个transcript上read的覆盖度;full_read_support  yes  当使用 RABT assembly 时，该选项报告所有的introns和exons是否完全被reads所覆盖

2. ispforms.fpkm_tracking

isoforms(可以理解为gene的各个外显子)的fpkm计算结果

3. genes.fpkm_tracking

gene的fpkm计算结果Cuffmerge简介

Cuffmerge将各个Cufflinks生成的transcripts.gtf文件融合称为一个更加全面的transcripts注释结果文件merged.gtf。以利于用Cuffdiff来分析基因差异表达。

2. 使用方法

$ cuffmerge [options]*

输入文件为一个文本文件，是包含着GTF文件路径的list。常用例子：

$ cuffmerge -o ./merged_asm -p 8 assembly_list.txt

3. 使用参数

-h | --help

-o  default: ./merged_asm

将结果输出至该文件夹。

-g | --ref-gtf将该reference GTF一起融合到最终结果中。

-p | --num-threads  defautl: 1

使用的CPU线程数

-s | --ref-sequence /该参数指向基因组DNA序列。如果是一个文件夹，则每个contig则是一个fasta文件；如果是一个fasta文件，则所有的contigs都需要在里面。Cuffmerge将使用该ref-sequence来帮助对transfrags分类，并排除repeats。比如transcripts包含一些小写碱基的将归类到repeats.  ]

4. Cuffmerge输出结果

输出的结果文件默认为 /merged.gtf

<1>命令：cufflinks -p 4 -o test_cuff /home/andengdi/lyr/rna-seq/02-align_out/test_output/accepted_hits.bam

流程及结果

5  为了得到匹配到的序列，将gif文件中的序列提取出来。