RNA-seq流程学习笔记（9）-使用RSeQC软件对生成的BAM文件进行质控

参考文章：
用RSeQC对比对后的转录组数据进行质控
高通量测序质控及可视化工具包RSeQC
RSeQC使用笔记

1. 质控的原因及相关软件

在A survey of best practices for RNA-seq data analysis里面，提到了人类基因组应该有70%~90%的比对率，并且多比对read（multi-mapping reads）数量要少。另外比对在外显子和所比对链（uniformity of read coverage on exons and the mapped strand）的覆盖度要保持一致。因此，可以对之前得到的BAM比对文件进行质检。

对BAM文件进行QC的软件包括：

Qualimap：对二代数据进行质控的综合软件

Picard：综合质控学习软件。

RSeQC是发表于2012年的一个RNA-Seq质控工具，属于python包。提供了一系列有用的小工具能够评估高通量测序尤其是RNA-seq数据。比如一些基本模块：检查序列质量、核酸组分偏性、PCR偏性、GC含量偏性，还有RNA-seq特异性模块：评估测序饱和度、映射读数分布、覆盖均匀性、链特异性、转录水平RNA完整性等。

2. RSeQC软件安装

参照文章：RNA-seq流程学习笔记（3）
查看Conda官网Index的RSeQC软件介绍，发现支持python3.6版本，因此直接使用Miniconda3安装， 安装完成后并没有RSeQC这个软件，而是增加了一些python命令，如下：

虽然该软件的使用命令非常多，但很多功能并不是用来诊断转录组测序的，所以不在我们的考虑范围内。

3.RSeQC处理4种文件格式:

1. BED 格式：Tab 分割，12列的表示基因模型的纯文本文件。
2. SAM 或BAM 格式： 用来存储reads比对结果信息，SAM是可读的纯文本文件，然而BAM是SAM的二进制文本，一个压缩的可索引的reads比对文件。
3. 染色体大小文件： 只有两列的纯文本文件，在“生物信息学文本处理大杂烩(一)”里已经讲过。hg19.chrom_24.sizes是人基因组hg19版本的size文件，是使用UCSC 的fetchChromSizes下载的。
4. Fasta文件。
   我主要使用的是比对后得到的BAM格式文件。

4. RSeQC软件进行质控检测

1. 使用bam_stat.py命令查看比对的总体情况

#命令说明
Usage: bam_stat.py [options]
Summarizing mapping statistics of a BAM or SAM file.
Options:
  --version             show program's version number and exit
  -h, --help            show this help message and exit
  -i INPUT_FILE, --input-file=INPUT_FILE
                        Alignment file in BAM or SAM format.
  -q MAP_QUAL, --mapq=MAP_QUAL
                        Minimum mapping quality (phred scaled) to determine
                        "uniquely mapped" reads. default=30

#操作记录
(base) zexing@DNA:~/projects/zhaoxiujuan/aligned$ bam_stat.py -i Scr.bam.sort
Load BAM file ...  Done

#==================================================
#All numbers are READ count
#==================================================

Total records:                          50976263

QC failed:                              0
Optical/PCR duplicate:                  0
Non primary hits                        5208051   #表示多匹配位点
Unmapped reads:                         1232377
mapq < mapq_cut (non-unique):           2464685
mapq >= mapq_cut (unique):              42071150
Read-1:                                 21096560
Read-2:                                 20974590
Reads map to '+':                       21026875
Reads map to '-':                       21044275
Non-splice reads:                       18498057
Splice reads:                           23573093
Reads mapped in proper pairs:           41139130
Proper-paired reads map to different chrom:0

确认代码：

bam_stat.py -i ${i}.bam.sort

2. 使用read_distribution.py命令查看基因组覆盖率

#命令说明：
Usage: read_distribution.py [options]
Check reads distribution over exon, intron, UTR, intergenic ... etc
The following reads will be skipped:
        qc_failed
        PCR duplicate
        Unmapped
        Non-primary (or secondary)
Options:
  --version             show program's version number and exit
  -h, --help            show this help message and exit
  -i INPUT_FILE, --input-file=INPUT_FILE
                        Alignment file in BAM or SAM format.
  -r REF_GENE_MODEL, --refgene=REF_GENE_MODEL
                        Reference gene model in bed format.
#该命令需要输入两个文件
# -i为BAM或SAM文件
# -r为参考的bed文件

BED文件可以直接从RSeQC网站下载：
此次练习中下载了人的BED文件，测序数据为小鼠来源，错误！！
下载如下：

#使用wget下载，发现报错，暂未解决。
#在windows 10下面右键保存（2.6M）
#使用scp file [email protected]：~/dir 命令将文件上传至服务器
#使用gzip命令对文件解压缩，压缩文件不能被识别
(base) zexing@DNA:~/projects/zhaoxiujuan/aligned/BED_file$ gzip -d hg19_RefSeq.bed.gz
(base) zexing@DNA:~/projects/zhaoxiujuan/aligned/BED_file$ ls
hg19_RefSeq.bed

操作记录：

(base) zexing@DNA:~/projects/zhaoxiujuan/aligned$ read_distribution.py -i ./Scr.bam.sort -r /f/xudonglab/zexing/projects/zhaoxiujuan/aligned/BED_file/hg19_RefSeq.bed
processing /f/xudonglab/zexing/projects/zhaoxiujuan/aligned/BED_file/hg19_RefSeq.bed ... Done
processing ./Scr.bam.sort ... Finished

Total Reads                   44535835
Total Tags                    75880491
Total Assigned Tags           37717256
=====================================================================
Group               Total_bases         Tag_count           Tags/Kb
CDS_Exons           35271889            808827              22.93
5'UTR_Exons         13156148            236757              18.00
3'UTR_Exons         35031450            586598              16.74
Introns             1249039112          30136632            24.13
TSS_up_1kb          19566867            461946              23.61
TSS_up_5kb          88704854            1929741             21.75
TSS_up_10kb         163160166           3349520             20.53
TES_down_1kb        20819429            527166              25.32
TES_down_5kb        89844112            1590630             17.70
TES_down_10kb       160449429           2598922             16.20
=====================================================================

可以用一个饼图来表示，在生信技能树论坛里面还有人专门提问过。（有待进一步研究）
关于RSeQC输出结果的保存，可以使用定向写入【>】来保存。

#使用重定向>命令将read_distribution命令的输出结果定向到指定Log文件中
(base) zexing@DNA:~/projects/zhaoxiujuan/aligned$ read_distribution.py -i ./Scr.bam.sort -r /f/xudonglab/zexing/projects/zhaoxiujuan/aligned/BED_file/hg19_RefSeq.bed > Scr_distribution.log
processing /f/xudonglab/zexing/projects/zhaoxiujuan/aligned/BED_file/hg19_RefSeq.bed ... Done
processing ./Scr.bam.sort ... Finished
(base) zexing@DNA:~/projects/zhaoxiujuan/aligned$ ll
total 277G
-rw-rw-r-- 1 zexing zexing 1.2K 6月   4 13:05 Scr_distribution.log
#使用cat命令查看运行结果
(base) zexing@DNA:~/projects/zhaoxiujuan/aligned$ cat Scr_distribution.log
Total Reads                   44535835
Total Tags                    75880491
Total Assigned Tags           37717256
=====================================================================
Group               Total_bases         Tag_count           Tags/Kb
CDS_Exons           35271889            808827              22.93
5'UTR_Exons         13156148            236757              18.00
3'UTR_Exons         35031450            586598              16.74
Introns             1249039112          30136632            24.13
TSS_up_1kb          19566867            461946              23.61
TSS_up_5kb          88704854            1929741             21.75
TSS_up_10kb         163160166           3349520             20.53
TES_down_1kb        20819429            527166              25.32
TES_down_5kb        89844112            1590630             17.70
TES_down_10kb       160449429           2598922             16.20
=====================================================================

关于RSeQC的其他使用方法，参考文章：用RSeQC对比对后的转录组数据进行质控
3. 使用shell script对多个数据执行以上命令
关于脚本，参考文章：Linux学习笔记-学习shell脚本的使用（持续更新）

#脚本如下
#!/bin/bash
#program:
#  This program is running RSeQC software command and saving the output results.
#History:
#    2020/06/04            zexing         First release
for i in msh1 msh2 m3108 m3110 m3111 m3112 m3113 m3114
do
    bam_stat.py -i ${i}.bam.sort > ${i}_bam_stat.log
    read_distribution.py -i ${i}.bam.sort -r /f/xudonglab/zexing/projects/zhaoxiujuan/aligned/BED_file/hg19_RefSeq.bed > ${i}_distribution.log
done
#后台执行该命令
(base) zexing@DNA:~/projects/zhaoxiujuan/aligned$ nohup sh -x RSeQC.sh &
[1] 172776