诺禾--实验篇之荧光定量 PCR（上）

首先，我们还是要一同温习一下何为荧光定量 PCR。荧光定量 PCR ( realtime fluorescence quantitative PCR，RTFQ PCR ）是一种定量实验技术，经过荧光染料或荧光标志的特异性的探针，对 PCR 产物停止标志跟踪，实时在线监控反响过程，分离相应的软件能够对产物停止剖析，计算待测样品模板的初始浓度。

概念十分浅显易懂，但是科研道路上还是有许多无法跳过的关卡，曾让小编夜不能眠、食不下咽，借此小编将实验中遇到的问题停止了记载和整理，共享给大家。

Q：要把 qPCR 实验做，统共分几步？
A：三步！
Q：哪三步？
A：前期准备、中期操作、后期剖析！

第三步会在下一专题和大家分享，今天先聊聊前两步：

一、qPCR 实验前期准备
前期准备主要是提取、反转录和引物设计局部，我们来逐一分享。

1. RNA 提取留意事项
   首先理解一下，RNA 抽提准绳：保证 RNA 的一级构造、无其它物质的污染、得率高、掩盖一切转录本。再比拟一下 Trizol 提取和试剂盒提取，Trizol 提取相对来说耗时长、含有害化学物质、纯度低、RNA 完好度不高；而试剂盒提取的优点是效率高、纯度高、完好度高，各位可依据实践科研状况选择操作办法。

RNA 提取留意事项：
① 运用无 RNase 的塑料制品和枪头，玻璃器皿要消毒，防止穿插污染；运用性能较好的移液器，如 Eppendorf、Thermo 等；
② DEPC 有剧毒，当心配制；配制溶液应运用无 RNase 的水；
③ 操作人员应戴一次性口罩和手套，实验过程中要勤换手套；
④ 样品应防止重复冻融，否则影响提取 RNA 提获得率和质量；
⑤ 若下游实验对 DNA 十分敏感，可用不含 RNase 的 DNase I 对 RNA 停止处置。

2. 反转录留意事项
   秉承防止 RNA 被污染和降解的准绳，依照产品阐明书停止即可，细致实验操作以及留意事项可参照之前已推出文章 干货 | 实验篇之RT-PCR，此文对反转录过程的引物设计和留意事项给出了较明白的提示。

3. qPCR 引物设计留意事项
   qPCR 过程中需求运用基因特异性引物扩增，从而剖析目的基因表达量。
   ① 引荐运用软件 Primer Premier 5.0；
   ② qPCR 过程中运用引物长度引荐 25bp ，扩增产物长度 150bp ，可在 100bp-300bp 之间；
   ③ 正向引物和反向引物的 Tm 值相差不宜超越2℃，Tm 值在 60℃-65℃ 之间为佳；
   ④ 引物碱基散布要平均，防止呈现连续的4个相同碱基，GC 含量控制在50%左右，3’端最后一个碱基最好为 G 或 C；
   ⑤ 引物内部或者正反两条引物间最好防止呈现有3个碱基以上的互补序列；
   ⑥ 引物特异性需求用 NCBI BLAST 程序停止核对。防止引物3’端有2个碱基以上的非特异性互补；
   ⑦ 引物设计完成后需停止扩增效率检测，将扩增效率相同的引物用于定量比拟剖析。

4. 实验办法的选择
   两步法：退火与延伸相同温度，最高能够到达72℃（很少采用），常用60℃，此温度下扩增引物二聚体和错配等扩增干扰较少，特异性高；每个循环时间较短，节约时间本钱。
   三步法：合适需求较高退火温度的引物，取得相对严谨的数据。

前期准备终了，我们就能够停止接下来的实验了，为了防止踩到坑里，请认真阅读！

二、qPCR 实验中期操作
中期操作主要分为试剂的存储、模板制备、体系配制、实验程序设置和内参选择几个局部，详细内容如下：

1. 试剂贮存
   -20℃ 避光长期贮存，防止重复冻融，运用前充沛混匀，但要防止产生气泡。局部试剂冻结后可能呈现絮状物质，4℃ 放置并上下颠倒混匀至溶液廓清，不影响试剂性能。

2. 模板的制备
   通常 1µg RNA 的反转录产物需求稀释10倍左右，以减轻 RNA 对 PCR 扩增的抑止。梯度稀释时，Ct 值落在15-28范围的稀释倍数作为原始模板稀释度，在此根底上停止5-10倍稀释。模板为 cDNA 原液时，上样量不超越 qPCR 反响总体积的1/10。

3. 体系配制
   ① 请于超净工作台内配制，并运用无核酸酶残留的枪头、反响管；引荐运用带滤芯的枪头，防止穿插污染和气溶胶污染。
   ② 引荐 10μL（q225、NOVO Max100）、20μL、50μL 体系；将引物和 qPCR Mix 混合配成大致系，混合平均，为防止误差，可多配制1-2个加样孔的量，保证体系稳定性。
   ③ 通常引物终浓度为 0.2μM，也能够依据状况在 0.1-1.0μM 之间停止调整。

4. 实验程序设置
   ① 预变性引荐时间5min，依据不同模板和引物的详细状况可恰当缩短至2min。此外，依据不同的厂家的产品能够有对应的预变性时间。
   ② 退火温度依据引物和目的基因的长度恰当调整。
   ③ 仪器需定期校准，此处整理不同 ROX 适用机型，给各位小同伴参考。

表1 不同荧光染料对应机型

5. 内参的选择
   内参基因通常指各种管家基因，各类管家基因在生物体各类细胞中都表达。理想的内参基因可在各类细胞或组织、各种实验条件下恒定表达。但是不同物种、不同组织的管家基因表达存在特异性，目前还未发现完整理想的内参。下表是已报道的局部物种的 qPCR 内参基因，仅供参考。

表2 已报道局部物种的 qPCR 内参基因

假如表格中的数据无法满足您的需求，我们再支一招！

6. 如何挑选内参基因？
   首先能够选择多个内参基因作为校正规范，再者能够运用 GeNorm、NormFinder 和 BestKeeper 比拟内参基因表达的稳定性，运用软件 GeNorm、基因芯片数据和 EST 数据库挑选内参基因。