R语言添加p-value和显著性标记

R语言添加p-value和显著性标记，原文链接 https://mp.weixin.qq.com/s/gRw0krS3LY7c0QK9y47EJw

作者简介 Introduction

taoyan：伪码农，R语言爱好者，爱开源。

个人博客: https://ytlogos.github.io/

往期回顾

• 一条命令轻松绘制CNS顶级配图-ggpubr
• R语言聚类分析–cluster, factoextra

上篇文章中提了一下如何通过ggpubr包为ggplot图添加p-value以及显著性标记,本文将详细介绍。利用数据集ToothGrowth进行演示。

ggpubr安装和加载

# 直接从CRAN安装
install.packages("ggpubr", repo="http://cran.us.r-project.org")

#先加载包
library(ggpubr)

#加载数据集ToothGrowth
data("ToothGrowth")
head(ToothGrowth)

数据格式如下：

   len supp dose
1  4.2   VC  0.5
2 11.5   VC  0.5
3  7.3   VC  0.5
4  5.8   VC  0.5
5  6.4   VC  0.5
6 10.0   VC  0.5

比较方法

R中常用的比较方法主要有下面几种：

方法	R函数	描述
T-test	t.test()	比较两组(参数)
Wilcoxon test	wilcox.test()	比较两组(非参数)
ANOVA	aov()或anova()	比较多组(参数)
Kruskal-Wallis	kruskal.test()	比较多组(非参数)

添加p-value

主要利用ggpubr包中的两个函数：

• compare_means():可以进行一组或多组间的比较

• stat_compare_mean():自动添加p-value、显著性标记到ggplot图中

compare_means()函数

该函数主要用用法如下：

compare_means(formula, data, method = “wilcox.test”, paired = FALSE,

group.by = NULL, ref.group = NULL, …)

注释：

formula:形如x~group，其中x是数值型变量，group是因子，可以是一个或者多个

data：数据集

method:比较的方法，默认为”wilcox.test”, 其他可选方法为：”t.test”、”anova”、”kruskal.test”

paired:是否要进行paired test(TRUE or FALSE)

group_by: 比较时是否要进行分组

ref.group: 是否需要指定参考组

stat_compare_means()函数

主要用法：

stat_compare_means(mapping = NULL, comparisons = NULL hide.ns = FALSE,

label = NULL, label.x = NULL, label.y = NULL, …)

注释：

mapping:由aes()创建的一套美学映射

comparisons:指定需要进行比较以及添加p-value、显著性标记的组

hide.ns:是否要显示显著性标记ns

label:显著性标记的类型，可选项为：p.signif(显著性标记)、p.format(显示p-value)

label.x、label.y:显著性标签调整

…:其他参数

比较独立的两组

compare_means(len~supp, data=ToothGrowth)

统计结果如下:

# A tibble: 1 x 8
    .y. group1 group2          p      p.adj p.format p.signif   method
  <chr>  <chr>  <chr>      <dbl>      <dbl>    <chr>    <chr>    <chr>
1   len     OJ     VC 0.06449067 0.06449067    0.064       ns Wilcoxon

结果解释：

.y:测试中使用的y变量

p:p-value

p.adj:调整后的p-value。默认为p.adjust.method=”holm”

p.format:四舍五入后的p-value

p.signif:显著性水平

method:用于统计检验的方法

绘制箱线图

# 绘制箱线图
p <- ggboxplot(ToothGrowth, x="supp", y="len", color = "supp",
  palette = "jco", add = "jitter") 
# 添加p-value, 默认是Wilcoxon test
p+stat_compare_means()

# 使用t-test统计检验方法
p+stat_compare_means(method = "t.test")

上述显著性标记可以通过label.x、label.y、hjust及vjust来调整
显著性标记可以通过aes()映射来更改：

aes(label=..p.format..)或aes(lebel=paste0(“p=”,..p.format..))：只显示p-value，不显示统计检验方法

aes(label=..p.signif..)：仅显示显著性水平

aes(label=paste0(..method..,”\n”, “p=”,..p.format..))：p-value与显著性水平分行显示

举个栗子：

# 显示显著性水平，位置在1.5两组间和Y轴40位置
p+stat_compare_means(aes(label=..p.signif..), label.x = 1.5, label.y = 40)
# 也可以将标签指定为字符向量，不要映射，只需将p.signif两端的..去掉即可
p+stat_compare_means(label = "p.signif", label.x = 1.5, label.y = 40)

比较两个paired sample

# 比较两个paired sample
compare_means(len~supp, data=ToothGrowth, paired = TRUE)

# 利用ggpaired()进行可视化
ggpaired(ToothGrowth, x="supp", y="len", color = "supp", line.color = "gray",
  line.size = 0.4, palette = "jco")+ stat_compare_means(paired = TRUE)

多组比较 Global test

anova进行多组比较

compare_means(len~dose, data=ToothGrowth, method = "anova")

统计结果如下：

# A tibble: 1 x 6
    .y.            p        p.adj p.format p.signif method
  <chr>        <dbl>        <dbl>    <chr>    <chr>  <chr>
1   len 9.532727e-16 9.532727e-16  9.5e-16     ****  Anova

可视化, default Kruskal-Wallis

ggboxplot(ToothGrowth, x="dose", y="len", color = "dose", palette = "jco")+
  stat_compare_means()

使用其他的方法，anova

#使用其他的方法, anova
ggboxplot(ToothGrowth, x="dose", y="len", color = "dose", palette = "jco")+
 stat_compare_means(method = "anova")

成对比较

默认进行两两比较

# Pairwise comparisons:如果分组变量中包含两个以上的水平，那么会自动进行pairwise test,默认方法为”wilcox.test”
compare_means(len~dose, data=ToothGrowth)

比较结果：

# A tibble: 3 x 8
    .y. group1 group2            p        p.adj p.format p.signif   method
  <chr>  <chr>  <chr>        <dbl>        <dbl>    <chr>    <chr>    <chr>
1   len    0.5      1 7.020855e-06 1.404171e-05  7.0e-06     **** Wilcoxon
2   len    0.5      2 8.406447e-08 2.521934e-07  8.4e-08     **** Wilcoxon
3   len      1      2 1.772382e-04 1.772382e-04  0.00018      *** Wilcoxon

可以指定比较哪些组

# 可以指定比较哪些组
my_comparisons <- list(c("0.5", "1"), c("1", "2"), c("0.5", "2"))
ggboxplot(ToothGrowth, x="dose", y="len", color = "dose",palette = "jco")+
  stat_compare_means(comparisons=my_comparisons)+ # Add pairwise comparisons p-value 
  stat_compare_means(label.y = 50) # Add global p-value

可以通过修改参数label.y来更改标签的位置

ggboxplot(ToothGrowth, x="dose", y="len", color = "dose",palette = "jco")+
stat_compare_means(comparisons=my_comparisons, label.y = c(29, 35, 40))+ # Add pairwise comparisons p-value
stat_compare_means(label.y = 45) # Add global p-value

至于通过添加线条来连接比较的两组，这一功能已由包ggsignif实现

设定参考组

设定参考组

compare_means(len~dose, data=ToothGrowth, ref.group = "0.5",  #以dose=0.5组为参考组
  method = "t.test" )
# 可视化
ggboxplot(ToothGrowth, x="dose", y="len", color = "dose", palette = "jco")+
  stat_compare_means(method = "anova", label.y = 40)+ # Add global p-value
  stat_compare_means(label = "p.signif", method = "t.test", ref.group = "0.5") # Pairwise comparison against reference

参考组也可以设置为.all.即所有的平均值

# 参考组也可以设置为.all.即所有的平均值
compare_means(len~dose, data=ToothGrowth, ref.group = ".all.", method = "t.test")
#可视化
ggboxplot(ToothGrowth, x="dose", y="len", color = "dose", palette = "jco")+
  stat_compare_means(method = "anova", label.y = 40)+# Add global p-value
  stat_compare_means(label = "p.signif", method = "t.test",
  ref.group = ".all.")#Pairwise comparison against all

为什么有时需要将ref.group设置为.all

接下来利用survminer包中的数据集myeloma来讲解一下为什么有时候我们需要将ref.group设置为.all.

# 利用survminer包中的数据集myeloma来讲解一下为什么有时候我们需要将ref.group设置为.all.
install.packages("survminer")
library(survminer) #没安装的先安装再加载
data("myeloma")
head(myeloma)

我们将根据患者的分组来绘制DEPDC1基因的表达谱，看不同组之间是否存在显著性的差异，我们可以在7组之间进行比较，但是这样的话组间比较的组合就太多了，因此我们可以将7组中每一组与全部平均值进行比较，看看DEPDC1基因在不同的组中是否过表达还是低表达。

compare_means(DEPDC1~molecular_group, data = myeloma, ref.group = ".all.", method = "t.test")

比较结果如下：

# A tibble: 7 x 8
     .y. group1           group2            p        p.adj p.format p.signif
                                         
1 DEPDC1  .all.       Cyclin D-1 2.877529e-01 1.000000e+00     0.29       ns
2 DEPDC1  .all.       Cyclin D-2 4.244240e-01 1.000000e+00     0.42       ns
3 DEPDC1  .all.     Hyperdiploid 2.725486e-08 1.907840e-07  2.7e-08     ****
4 DEPDC1  .all. Low bone disease 5.258400e-06 3.155040e-05  5.3e-06     ****
5 DEPDC1  .all.              MAF 2.538126e-01 1.000000e+00     0.25       ns
6 DEPDC1  .all.            MMSET 5.784193e-01 1.000000e+00     0.58       ns
7 DEPDC1  .all.    Proliferation 2.393921e-05 1.196961e-04  2.4e-05     ****
# ... with 1 more variables: method 

可视化DEPDC1基因表达谱

ggboxplot(myeloma, x="molecular_group", y="DEPDC1",
  color = "molecular_group", add = "jitter", legend="none")+
  rotate_x_text(angle = 45)+
  geom_hline(yintercept = mean(myeloma$DEPDC1), linetype=2)+# Add horizontal line at base mean
  stat_compare_means(method = "anova", label.y = 1600)+ # Add global annova p-value
  stat_compare_means(label = "p.signif", method = "t.test", ref.group = ".all.")# Pairwise comparison against all

从图中可以看出，DEPDC1基因在Proliferation组中显著性地过表达，而在Hyperdiploid和Low bone disease显著性地低表达

我们也可以将非显著性标记ns去掉，只需要将参数hide.ns=TRUE

ggboxplot(myeloma, x="molecular_group", y="DEPDC1",
  color = "molecular_group", add = "jitter", legend="none")+
  rotate_x_text(angle = 45)+
  geom_hline(yintercept = mean(myeloma$DEPDC1), linetype=2)+# Add horizontal line at base mean
  stat_compare_means(method = "anova", label.y = 1600)+ # Add global annova p-value
  stat_compare_means(label = "p.signif", method = "t.test", ref.group = ".all.", hide.ns = TRUE)# Pairwise comparison against all

分面多组同时比较

按另一个变量进行分组之后进行统计检验，比如按变量dose进行分组：

compare_means(len~supp, data=ToothGrowth, group.by = "dose")
#可视化
p <- ggboxplot(ToothGrowth, x="supp", y="len", color = "supp",
 palette = "jco", add = "jitter", facet.by = "dose", short.panel.labs = FALSE)#按dose进行分面
#label只绘制p-value
p+stat_compare_means(label = "p.format")

# label绘制显著性水平
p+stat_compare_means(label = "p.signif", label.x = 1.5)

将所有箱线图绘制在一个panel中

# 将所有箱线图绘制在一个panel中
p <- ggboxplot(ToothGrowth, x="dose", y="len", color = "supp",
               palette = "jco", add = "jitter")
p+stat_compare_means(aes(group=supp))
# 只显示p-value
p+stat_compare_means(aes(group=supp), label = "p.format")
# 显示显著性水平
p+stat_compare_means(aes(group=supp), label = "p.signif")

进行paired sample检验

compare_means(len~supp, data=ToothGrowth, group.by = "dose", paired = TRUE)
# 可视化
p <- ggpaired(ToothGrowth, x="supp", y="len", color = "supp",
    palette = "jco", line.color="gray", line.size=0.4, facet.by = "dose",
    short.panel.labs = FALSE) # 按dose分面
# 只显示p-value
p+stat_compare_means(label = "p.format", paired = TRUE)

其他图形

有误差棒的条形图

实际上我以前的文章里有纯粹用ggplot2实现

ggbarplot(ToothGrowth, x="dose", y="len", add = "mean_se")+
  stat_compare_means()+
  stat_compare_means(ref.group = "0.5", label = "p.signif", label.y = c(22, 29))

有误差棒的线图

ggline(ToothGrowth, x="dose", y="len", add = "mean_se")+
  stat_compare_means()+
  stat_compare_means(ref.group = "0.5", label = "p.signif", label.y = c(22, 29))

条形图(两个分组变量)

ggbarplot(ToothGrowth, x="dose", y="len", add = "mean_se", color = "supp",
  palette = "jco", position = position_dodge(0.8))+
  stat_compare_means(aes(group=supp), label = "p.signif", label.y = 29)

线图-两分组

# line, multiply pair group
ggline(ToothGrowth, x="dose", y="len", add = "mean_se", color = "supp",
  palette = "jco")+
  stat_compare_means(aes(group=supp), label = "p.signif", label.y = c(16, 25, 29))

环境信息

sessionInfo()

信息如下：

R version 3.4.3 (2017-11-30)
Platform: x86_64-w64-mingw32/x64 (64-bit)
Running under: Windows >= 8 x64 (build 9200)

Matrix products: default

locale:
[1] LC_COLLATE=Chinese (Simplified)_China.936 
[2] LC_CTYPE=Chinese (Simplified)_China.936   
[3] LC_MONETARY=Chinese (Simplified)_China.936
[4] LC_NUMERIC=C                              
[5] LC_TIME=Chinese (Simplified)_China.936    

attached base packages:
[1] stats     graphics  grDevices utils     datasets  methods   base     

other attached packages:
[1] survminer_0.4.2  bindrcpp_0.2     ggpubr_0.1.6.999 magrittr_1.5    
[5] ggplot2_2.2.1   

loaded via a namespace (and not attached):
 [1] Rcpp_0.12.13        compiler_3.4.3      plyr_1.8.4         
 [4] bindr_0.1           tools_3.4.3         digest_0.6.15      
 [7] tibble_1.3.4        gtable_0.2.0        nlme_3.1-131       
[10] lattice_0.20-35     pkgconfig_2.0.1     rlang_0.1.4        
[13] Matrix_1.2-12       psych_1.7.8         ggsci_2.8          
[16] cmprsk_2.2-7        yaml_2.1.15         parallel_3.4.3     
[19] gridExtra_2.3       knitr_1.19          dplyr_0.7.4        
[22] stringr_1.2.0       survMisc_0.5.4      grid_3.4.3         
[25] tidyselect_0.2.3    data.table_1.10.4-3 glue_1.2.0         
[28] KMsurv_0.1-5        R6_2.2.2            km.ci_0.5-2        
[31] survival_2.41-3     foreign_0.8-69      tidyr_0.8.0        
[34] purrr_0.2.4         reshape2_1.4.2      splines_3.4.3      
[37] scales_0.5.0        assertthat_0.2.0    mnormt_1.5-5       
[40] xtable_1.8-2        colorspace_1.3-2    ggsignif_0.4.0     
[43] labeling_0.3        stringi_1.1.5       lazyeval_0.2.1     
[46] munsell_0.4.3       broom_0.4.3         zoo_1.8-1

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