ATAC-seq原理及现有技术的比较

Chromatin accessibility and the regulatory epigenome Sandy 文献阅读及分析总结

在开始讲述之前，我们先来了解一下本文中接下来的几种染色质可接近性的技术，主要包括早期的DNase-seq技术，ATAC-seq技术。
首先对于染色质的可接近性的评估
对于染色质的可接近性的评估，通常是通过量化染色质的甲基化状态以及对DNase的敏感性来量化的。DNA超敏感化，于1973年，Hewish和他的同事使用DNA内切酶对染色质进行片段化，显示核小体在整个基因组中具有周期性超敏反应，即在染色体上存在对DNA酶敏感的位点，这些位点证实裸漏在染色体上无组蛋白包裹的DNA。DNA超敏感位点呈现出周期性的规律，即切割后的DNA片段都在100-200bp左右，这也证实了染色体的基本单位核小体的存在。

第一个大规模应用染色体可接近技术的方法是在2006年，当时在一对研究中首次报道了开放染色质的基因组尺度测量，该研究将从天然染色质中分离的DNA酶切片段杂交到覆盖人类基因组1%的平铺微阵列上。这也是最早的DNase-seq技术，研究者们通过短读长测序，即DNase-seq来研究染色质的可接近性。

本文中介绍的第二种技术是ATAC-seq，这种技术，主要是利用超活性的Tn5转座酶，通过在转座酶复合物上连接上测序的barcode,在进一步在转座酶复合物的作用下，在染色质的可接近进区域插入转座酶所需要的序列(带有barcode)。ATAC-Seq可接近性测量与双切（R>0.8）和单切（R>0.75）DNA序列分析高度相关，尽管高分辨率分析（如TF足迹）可以揭示序列偏差的差异。由于Tn5介导的适配器连接的高效性，仅500个细胞就产生了高度复杂的ATAC序列库，因此这初步揭示了ATAC-seq的优势，他所需要的细胞以及材料较少，相对测序结果的匹配率要高因为其朱永通过Tn5转座酶进行介导测序。与此同时，若那相同的细胞进行测序，ATAC-seq测序速度明显要比DNase-seq快得多。

本文介绍的第三种方法，被称为微球珠核酸酶测序-MN-seq,MNase既可以作为一种内切酶来切割细胞核间dna，也可以作为一种外切酶来降解不受蛋白质保护的切割产物dna。MNase-seq和DNase-seq以及ATAC-seq和之间区别主要是，在后两者中不存在外切酶对DNA的切割。由于外切酶对没有核小体保护的DNA的切割效率要高于有核小体包被的DNA，因此这种方法，更多的是用来分离核小体保护的DNA片段。而在这种技术中，他对于MNase酶剂量依赖性也很强。有研究者表明mnase-seq在建库的过程中，可接近的dna的表达随着核酸酶浓度的降低而减少（可能是由于外切酶介导的消化），而受保护的核体dna相对丰度增加，这是由于核酸内切酶介导的核体dna切割。MACC信号在潜在的活跃调控区域，比如说H3K27Ac以及转录起始区的DNase超敏感位点以及，启动子，增强子等有关，而与转录终止子无关。

最后一种是核小体占位和甲基化测序，Nucleosome-occupancy and methylome-sequencing (NOMe­ seq)，使用来自mcvipi的gpc甲基转移酶（mtase）通过化学修饰而不是切割可接近的dna来探测染色质可接近性。
而这种甲基化与内源性的甲基化不同，它们发生在GC2核苷酸的异位，而非内源的甲基化酶的位置。NOMe-seq以高分辨率同时探测dna的可接接近性和甲基化状态，因为gpc在整个基因组中的频率很高。另外值得一提的是NOMe-seq并不是一种富集的方法，因此需要相对大量的测序读数来获得足够的深度来确定整个基因组的可获得性水平。

除了以上的几种比较传统的染色质可接近性的方法之外，近些年来，随着单细胞测序技术的发展，单细胞水平的然则是可接近技术也在逐步发展。组合索引提供了一个优雅的策略来对数以千计的单细胞ATAC-SEQ文库进行加上barcode。在这种方法中，用独特的barcode的TN5酶在纯化的细胞核上进行多次转位反应，然后在稀释稀释液中汇集并分裂成多个索引PCR反应。这种方法利用了共享同一转位反应的任何一对细胞在随后的池和分裂操作中共同分离的低概率，因此不需要分离单个细胞。组合索引已被用于分析在成千上万个单细胞上的可访问性在单细胞测序的基础上。细胞atac-seq也通过在微流控装置（fluigm，c1）8内或在纳米井阵列单个可转位井内捕获单个细胞来实现。在早期造血过程中，微流控捕获已被用于描绘数千个单个细胞的可接近性30,31，而纳米井阵列有望进一步将微流控方法的吞吐量提高一个数量级。比较这两个平台与COM二进制索引方法反映了一个自然的贸易问题：虽然每一个处理微流体和纳米阱阵列平台的细胞更少，单细胞库的复杂度至少是两倍高的库的复杂性的差异是一个关键参数，考虑到即使是无处不在的开放区域的稀疏采样（平均而言，仅使用C1平台31在单细胞中观察到所有开放区域的10%），并且我们预期在短期内这两种方法的库的复杂性都会有所改善。单细胞atac-seq最近已经在10x基因组学和bio-rad实验室基于液滴的微流控平台上实现。早期报告显示，这些高通量平台将提供与纳米井捕获技术相似的数据质量。