扩增子统计绘图3热图：样品相关分析，差异OTU

写在前面

优秀的作品都有三部分曲，如骇客帝国、教父、指环王等。

扩增子系列课程也分为三部曲：

第一部《扩增子图表解读》：加速大家对同行文章的解读能力。

第二部《扩增子分析解读》：学习数据分析的基本思路和流程。

第三部《扩增子统计绘图》：即是对结果进行可视和统计检验，达到出版级的图表结果。

《扩增子统计绘图》系列文章介绍

《扩增子统计绘图》是之前发布的《扩增子图表解读》和《扩增子分析解读》的进阶篇，是在大家可以看懂文献图表，并能开展标准扩增子分析的基础上，进行结果的统计与可视化。其章节设计与《扩增子图表解读》对应，为八节课八种常用图形(箱线图、散点图、热图、曼哈顿图、火山图、维恩图、三元图和网络图)，基本满足文章常用的图片种类需求。

也适合对公司标准化分析返回结果的进一步统计、可视化及美化，达到出版级别，冲击高分文章。

本部分练习所需文件位于百度网盘，链接：http://pan.baidu.com/s/1hs1PXcw 密码：y33d。

1箱线图：Alpha多样性
2散点图：Beta多样性，PCoA, CCA

热图展示样品相关性

# 运行前，请在Rstudio中菜单栏选择“Session - Set work directory -- Choose directory”，弹窗选择之前分析目录中的result文件夹

# 读入实验设计
design = read.table("design.txt", header=T, row.names= 1, sep="\t") 

# 读取OTU表
otu_table = read.delim("otu_table.txt", row.names= 1,  header=T, sep="\t")

# 过滤数据并排序
idx = rownames(design) %in% colnames(otu_table) 
sub_design = design[idx,]
count = otu_table[, rownames(sub_design)]

# 转换原始数据为百分比
norm = t(t(count)/colSums(count,na=T)) * 100 # normalization to total 100

# 计算所有样品间相关系数
sim=cor(norm,method="pearson")

# 使用热图可视化，并保存为8x8英寸的PDF
library("gplots")
library("RColorBrewer")
pdf(file=paste("heat_cor_samples.pdf", sep=""), height = 8, width = 8)
# 想预览，跳过上面Pdf行直接运行heatmap.2
heatmap.2(sim, Rowv=TRUE, Colv=TRUE, dendrogram='both', trace='none', margins=c(6,6), col=rev(colorRampPalette(brewer.pal(11, "RdYlGn"))(256)),density.info="none") 
dev.off()

图1. 热图展示所有样品基于相对丰度的Pearson相关系数矩阵。我们可以看到样品明显分成了三类，KO，OE，WT，表明该基因的过表达和基因敲除对菌群均有影响，其中过表达到WT差异明显。其中KO3与WT聚在了一起，表明其野生型相似，我能想到三种可能：过表达的基因被沉默而回复成与野生型相似；该份材料的种子是混入的WT；可能该材料的标WT串成了KO3。

edgeR统计组间差异OTU

# 使用edgeR统计组间差异OTU，以OE vs WT为例

library(edgeR)
# create DGE list
d = DGEList(counts=count, group=sub_design$genotype)
d = calcNormFactors(d)

# 生成实验设计矩阵
design.mat = model.matrix(~ 0 + d$samples$group)
colnames(design.mat)=levels(genotypes)
d2 = estimateGLMCommonDisp(d, design.mat)
d2 = estimateGLMTagwiseDisp(d2, design.mat)
fit = glmFit(d2, design.mat)

# 设置比较组
BvsA <- makeContrasts(contrasts = "OE-WT", levels=design.mat)
# 组间比较,统计Fold change, Pvalue
lrt = glmLRT(fit,contrast=BvsA)
# FDR检验，控制假阳性率小于5%
de_lrt = decideTestsDGE(lrt, adjust.method="fdr", p.value=0.05)

# 导出计算结果
x=lrt$table
x$sig=de_lrt
enriched = row.names(subset(x,sig==1))
depleted = row.names(subset(x,sig==-1))

热图展示差异OTU

## 热图展示差异OTU
pair_group = subset(sub_design, genotype %in% c("OE", "WT"))
# Sig OTU in two genotype
DE=c(enriched,depleted)
sub_norm = as.matrix(norm[DE, rownames(pair_group)])
#colnames(sub_norm)=gsub("DM","KO",colnames(sub_norm),perl=TRUE) # rename samples ID
pdf(file=paste("heat_otu_OEvsWT_sig.pdf", sep=""), height = 8, width = 8)
# scale in row, dendrogram only in row, not cluster in column
heatmap.2(sub_norm, scale="row", Colv=FALSE, Rowv=FALSE,dendrogram="none", col=rev(colorRampPalette(brewer.pal(11, "RdYlGn"))(256)), cexCol=1,keysize=1,density.info="none",main=NULL,trace="none")
dev.off()

图中可到OTU95在OE中高表达，而其它OTU均在OE中下调；表达该基因的表达，主要来拟制一些OTU。这些OTU的编号较大，代表其丰度较高。比如OTU_1，就是聚类结果中最高丰度的OTU。

详细的图片讲解，可参考3热图：差异菌、OTU及功能

热图的进一步绘制学习材料：热图绘制 (heatmap) 热图美化 热图简化

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