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点击发表期刊：ISI Journal Citation Reports
Editor-in-Chief: Professor Peter Lichter, DKFZ, Germany
Impact factor:7.36
ISI Journal Citation Reports © Ranking: 2017:23/223 (Oncology)
Online ISSN:1097-0215
background
结直肠癌（CRC）是世界上最常见的恶性肿瘤之一。多发性结直肠癌是指在第一次诊断时在单个患者中检测到的多于一种原发性肿瘤。多发性CRC病例的总体死亡率显着高于单独的CRC，占所有CRC病例的3.5％左右。与单独CRC相比，多发性CRC在男性和结肠近端部分的发病率较高，粘液腺癌和微卫星不稳定的发生率较高，更可能与腺病，炎症性肠病（IBDs），遗传性非息肉性CRC和家族性腺瘤性息肉病（FAP）等诱发病症有关。
已经提出了两个假设来解释这些物理上分离的独立肿瘤的发生。The clonal hypothesis认为多灶性肿瘤起源于同一起源，即创始肿瘤，而其他肿瘤是通过来自创始肿瘤的细胞的腔内或上皮内接种而形成的。相反，the field hypothesis强调了肿瘤微环境在多种肿瘤发生中的重要性。致癌物可以部分转化大面积细胞，然后通过随后获得的额外突变诱导肿瘤转化。因此，每个假设将产生不同的遗传特征，癌症通过转化突变的连续累积而发生
多发性CRC的比较分析主要集中在微卫星的状态，错配修复蛋白和已知癌基因的突变热点上。由于癌症在遗传上不稳定，仅通过选择的突变标记研究配对肿瘤之间的关系可能会大大改变其预测的分子起源。因此，我们假设研究多发性CRC遗传起源的更好方法是通过下一代测序产生的数千个unbiased genetic markers。
该研究对来自15名患者的32个新鲜冷冻肿瘤病灶进行了全外显子组测序（WES）。排除具有癌症发展倾向的同步CRC患者。通过分析体细胞突变，拷贝数改变，克隆结构和受影响的信号传导途径。除了明显的肿瘤间异质性，研究结果表明多发性CRC的不同遗传起源。
Material and Methods
Tumor specimen
15名患有多发性CRC患者，接受肿瘤切除手术，所有手术切除的肿瘤组织都是新鲜冷冻的，对于每个同步肿瘤对，将匹配的血液样品或正常的肿瘤周围组织作为参考。共47例样本进行外显子测序，其中32例为癌灶，15例为配对血液或非癌变的组织样本。
DNA extraction and library preparation
使用QIAamp DNA Mini Kit（Qiagen，Dusseldorf，Germany）按照制造商的说明提取来自肿瘤对和参考样品的基因组DNA。
Whole exome sequencing
用Illumina HiSeq X10对扩增的正常和肿瘤DNA文库进行测序，产生150bp的配对末端序列，产生FASTQ文件。
Reads alignment
使用BWA（Burrows-Wheeler Aligner，版本0.7.10）将所有正常和肿瘤测序的读数与参考人类基因组（GRCh37）比对，随后通过GATK（Genome Analysis Toolkit，版本2.3.1）进行重新校正以纠正由于相对于参考基因组在个体基因组中存在局部插入或缺失而导致的错配。重新调整后，用Picard（版本1.103）用于标记重复读取和GATK以生成基础重新校准表以补偿系统错误。最终的BAM文件用作 variants calling
Somatic variant calling and filtering
通过比较肿瘤的测序读数和匹配的正常基因组，用MuTect (version 1.1.6)进行SNV调用，用Strelka（版本1.0.14）进行INDEL调用。然后我们应用vcf2maf来注释所有体细胞变体，如癌症体细胞突变目录（COSMIC）和单核苷酸多态性数据库（dbSNP138）。使用IGV（Integrative Genomics Viewer，版本2.3.34）目测检查编码区中的所有变体以进行验证。使用MutsigCV1.4软件分析通过MuTect鉴定为PASS的过滤突变，通过该软件富集候选癌症驱动基因（p <0.05）。对所有频繁突变的基因进行聚合酶链式反应（PCR）和Sanger测序以验证WES并评估呼叫的准确性。
Mutation validation by PCR-based Sanger sequencing
采用touch-down PCR方法扩增基因组DNA中的靶向突变位点。
Copy number profiling
使用Sequenza （版本2.1.2 ）进行肿瘤纯度分析，从所有32个肿瘤样本的测序数据中推断出13个拷贝数变异。使用CNVkit（版本0.8.2 ）用于拷贝数变异可视化。
Clonal structure construction
使用sequenza2PyClone module构建克隆文件，然后根据MuTect结果对输入文件进行过滤。再使用PyClone（版本 0.13.1 ）计算不同肿瘤标本的共有突变，推断出肿瘤克隆群体的结构。
Gene Ontology (GO) enrichment analysis for all mutations
通过超几何分布检验计算出每个GO项中的多个不同基因的显著性，计算返回p值，说明富集的意义。p值越低表示越富集。
Drug-gene interaction database screening
利用The Drug Gene Interaction Database (http://dgidb.ge
nome.wustl.edu/) 来预测可操作和可用的突变基因。
result
(A)12例非增生性肿瘤患者的INDEL(橙色)、同义(绿色)和非同义SNVS(紫色)。
(B)3例高突变肿瘤患者的INDEL、同义和非同义SNV。
(C)15例同步性CRC患者的突变谱
多发性CRC不同病变中肿瘤基因的突变。
上面的面板显示每个样本的癌症基因突变率，根据目标序列的每兆位突变数(Mb)计算。包括非同义突变(红色)和同义突变(绿色)。
中央矩阵显示突变的癌症基因和突变类型(代表不同的颜色，如左上角所示)。每一列代表一个肿瘤病变，每一行代表一个癌症基因。病人ID列在图的底部。空白网格显示样品的相应基因没有突变或功能突变。左面板上的红条表示突变基因样本的比例。右边面板上的灰条显示sms排名。
15例同步性CRC患者的SCNV分析。
(A)12例同步性CRC伴非增生性肿瘤的SCNV热图。
(B)3例同步性CRC伴增生性肿瘤的SCNV热图。
热图中的颜色表示拷贝数的增加(红色)和丢失(蓝色)。
肿瘤通常由多个基因型不同的细胞群组成，称为克隆。这些克隆是通过系统发育联系起来的。在肿瘤进展过程中，他们接受肿瘤微环境的选择和药物干预。为了研究不同肿瘤在一个个体中的发生是否需要获得相同的基因事件，或者它们是否是由dis-tent因素驱动的，然后我们比较了同一患者不同肿瘤的克隆成分。将被深度测序的体细胞突变组合成克隆簇，同时估计它们的细胞Preva-lence，并解释由scnvs和正常细胞污染引起的等位基因失衡。簇的概率密度指示突变的细胞发生率；换句话说，对应的亚克隆细胞在每个样本中所占的比例。宽度越大意味着一定比例的细胞流行能力越强，散射范围越广，表明突变的细胞流行率存在不确定性。14例多发性CRCs克隆群体结构的研究患者的样本中没有足够的普遍存在的突变来构建克隆群体结构。每个簇的细胞流行率的后向分布表现为不同颜色的小提琴情节预测。每个簇的突变数显示在水平轴上。
同一患者不同的肿瘤克隆结构表明其表型的遗传决定因素不同，不同的肿瘤有各自的生长和增殖能力。因此，它们可能具有不同的转移潜能或化疗耐药性。在相同的肿瘤微环境中，不使用药物的情况下，来自同一患者的肿瘤含有不同的克隆。
我们观察到在多发性CRC患者中，癌基因中的scnvs和SNVS以及不同病灶之间的其他基因几乎没有共享的scnvs和SNVS。SCNVS常通过癌基因的过度表达或抑癌基因的下调而产生促进肿瘤生长的基因剂量效应。4该研究结果表明，在肿瘤演化的早期阶段，同一患者的肿瘤病变所获得的拷贝数的变异大部分是不同的。普遍存在的突变也代表了肿瘤发生过程中相对较早的事件，因为它们发生在最近的克隆扩张之前。根据我们的数据，不仅在多发性CRC中发现了几个普遍变异的基因，而且在同步CRC中也发现了普遍突变的基因和癌症基因在不同的位点发生突变，这表明它们积累的时间是不同的。因此，同一患者肿瘤的克隆结构不同，而同期CRC患者驱动通路改变的次数变化很大。
这表明散发性同步CRCs具有不同的遗传来源。这一发现对遗传预后和预测生物标志物的发展有着重要的意义：(1)对于鉴别诊断，应检查多个活检，因为单个活检可能错过导致CRC分类错误的基因不同的肿瘤病变；(2)必须澄清个别恶性克隆对疾病进展的贡献方式。结果表明，由于免疫相关基因的损伤性改变，独立型肿瘤的发生频率可能会增加，这意味着炎症微环境通过增加基因组不稳定性或通过细胞因子和生长因子的分泌而有利于肿瘤的发生。
我们对15例散发性同步CRCs的分析表明，同一患者的同步肿瘤具有不同的遗传来源，它们是由不同的驱动基因诱发的，并在肿瘤进展过程中产生不同的体细胞突变。来自同一患者的不同的SCNVS和突变支持了同步肿瘤发生的场效应理论。此外，同步CRCs的肿瘤间异质性表明，对同一患者的所有肿瘤病变进行分析，对于适当的临床治疗是必要。
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文章链接：http://sci-hub.tw/https://doi.org/10.1002/ijc.31140