神经科学体外模型:SH-SY5Y细胞分化为具有成熟神经元形态和生化特征的细胞

（2区 林雪平大学 300左右）
摘要：我们的目标是开发一个改进的体外模型，产生具有人类成熟神经元形态和生物化学的可持续细胞。为了获得具有神经分化和功能的细胞，我们研究了细胞外基质(ECM)凝胶中SH-SY5Y细胞的三维培养与报道的几种具有神经分化作用的因素相结合的效果。这导致细胞具有明显的神经元形态与长，广泛分支的神经元突起。进一步的研究揭示了包括突触蛋白Sv2和核标记物NeuN在内的几种神经特异性标志物的表达，以及突触和轴突囊泡转运的存在。此外，这些细胞表达成熟的tau亚型，与未分化的细胞相比，tau蛋白表达显著增加，达到成人大脑的水平。
介绍：神经元特异性蛋白很少在SH-SY5Y细胞中表达和分布，其水平与成熟神经元相当。蛋白质的多样性作为成熟神经元的标记，比如神经元等特定β-III微管蛋白，这是几乎只在完全表达在神经元和分化的标志和减少核扩散特定β-III神经元微管蛋白，是分化与增殖抑制的标志。突触的标记物是突触囊泡蛋白Sv2。突触的标志物是突触囊泡蛋白Sv2，一种存在于神经元和内分泌细胞突触前囊泡中的糖蛋白，参与突触结构和递质释放。此外，神经特异性核标记物NeuN是有丝分裂后神经元的标记物，也是成熟的标记物。
Tau是微管结合蛋白，对微管的稳定性、轴突的发育和转运具有重要意义。Tau蛋白与包括AD在内的几种神经退行性疾病有关。有报道称在未分化的SY5Y发现了该物质，因此不可作为成熟大脑的标志物。Tau在成熟人神经元和培养细胞中的表达和分布是不同的。在成熟的人神经元中，Taught主要存在于周图中，而在培养的细胞中存在于包括细胞体在内的整个细胞中。在研究AD时，越来越多的人关注微管功能和轴突转运。因此，建立一简单可行的细胞模型是非常重要的。
细胞培养：SY5Y、10%胎牛血清，每周换液两次。使用了两批不同的细胞，传代数不超过25。先用RA（10μM）预处理一周，再用RA或BDNF处理。细胞悬液与预冷ECM凝胶1:1混合，置于预冷的24孔板中，每孔20w个cells。将细胞在37℃环境下培养两天，RA的不同组合，BDNF、neuregulinβ1、神经生长因子、维生素D3,胆固醇被添加到培养基中。3-4d换液一次，加BDNF时，换用无血清培养基。先在培养瓶中用RA处理7天，然后混合凝胶培养。
形态分类：细胞分化10或21天，第0、5、10、15、20天时用尼康TMS-F相差显微镜观察细胞形态。两个独立的观察员按如下的方法进行形态学鉴定。根据以下三个特征，分析了来自至少两个独立实验的三个样本：生长抑制、神经突长度、神经突分支。生长抑制根据第0天与第十天的细胞数量测定：无限增殖为+，中间抑制为++，数量少于第0天为+++。神经突长度测定：短而直+、长度超过半个相框（放大倍数？）为+++，其余为++；关于神经突分支的标准分别进行了排名：其中治疗导致大多数细胞没有分支的神经突给予+、分支较多但短的为++、大多数细胞出现多分枝的神经元突起，分枝点后生长广泛为+++；
活细胞成像：
免疫化学细胞分析：
量化：NeuN染色量化，ImageJ software对免疫染色荧光强度进行量化(NIH)。每种处理方法，分析了10张图像（来自于两个独立实验各5张），选取核面积(从ToPro3染色核图像中获取)，分析每个核面积内的强度。记录每幅图像中核面积的平均值，然后计算总体平均值（10个样本）。
RESULT
形态学分析：
分化处理时间延长至21天，并未发现形态学上进一步的变化。

Cells with neuron-like morphology express synapse-specific proteins and display synaptic structures（具有神经元样形态的细胞表达突触特异性蛋白，并显示突触结构）
用RA在培养瓶中处理7天后，接种到凝胶中，24h后进行免疫组化。由于RA的作用，微观蛋白β-3染色强度低，Sv2染色强度低或仅局限于细胞核周围。

在凝胶中用RA处理的细胞，β-iii和Sv2（仍集中于胞体）染色强度略有提升，

Differentiation of SH-SY5Y cells is accompanied by increased expression of neuron-specific protein NeuN.（分化随着NeuN的增加进行）
为进一步分析分化细胞的形态，对特异性神经标志物NeuN进行免疫组化染色。RA处理的SY5Y NeuN染色不明显，在凝胶中处理的略显积极。
Differentiation of SH-SY5Y cells increases tau expression and induce a neuritic distribution（分化导致Tau表达增加，诱导神经元分布）
RA诱导7天的SY5Y，Tau染色不良。
Discussion
按照我们方法处理的SY5Y细胞，分化良好且表达成熟神经元特有的特征，如突触结构和功能轴突囊泡运输。分化最成功的细胞还表达了特异性神经元蛋白，如核蛋白质蛋白NeuN、β-iii、突触蛋白Sv2等。tau蛋白的表达水平可与成人大脑相媲美，并包含成熟的亚型，这使得这个体外分化的新概念对包括AD在内的许多神经科学研究领域都有价值。