标记蛋白组 VS label free蛋白组学

非靶向蛋白组定量分析，分为两类，近年来比较热门的应该是以iTRAQ和TMT为代表的标记技术。第二类是非标记（Label free）蛋白定量，他们有什么区别呢？

1、iTRAQ的肽段标记 V.S. Lable free的无标记——iTRAQ容易引入实验误差，也会受到标签种类限制。

iTRAQ由于实验需要，会在蛋白样本酶解成肽段后，给不同样本的肽段标记上等重同位素标签（图1）；Label free不对样本进行标记（图2）。标记步骤使得iTRAQ技术在第一步引入实验误差，而且标签种类（8个）限制了iTRAQ一批次比较的样品个数。

图1 iTRAQ流程示意图

蛋白提取-酶解-标记-混合上机-标签碎裂-通过二级谱图报告集团峰强度定量

图2 label free流程示意图

蛋白提取-酶解-样本分别上机-通过比较样本的峰面积定量

2、iTRAQ样本混合上机 V.S. Label free升级版样本分别上机——10个样本以内的定量比较，Label free升级版再准，也难超iTRAQ。

iTRAQ标记后样本混合上机，避免分批次上机引入的实验误差，理论上可实现100%平行比较；label free升级版样本分别上机，即便是使用高稳定性质谱仪和iRT矫正工具，理论上也无法实现100%的平行比较。（参考图1、2）

3、iTRAQ液相色谱（LC）分组分 V.S. Label free升级版不分组——iTRAQ分组分鉴定率高，Label free升级版不分组鉴定难度大，需增加谱图库的建库成本。

iTRAQ在LC-MS/MS前进行一向液相色谱分多个（一般为20个）组分，充分降低样本复杂程度，鉴定效果好；Label free升级版为了压缩单个样本上机时间，一般不进行一向液相色谱分组，样本复杂程度相对较高，鉴定难度大。

为了获得更好的鉴定效果，Label free升级版在样本上机前需要构建一个分组的混合样品库，辅助进行样本的蛋白鉴定，完美解决样本鉴定难度大的问题，但会增加成本。

4、iTRAQ DDA V.S. Label free升级版 DIA——DIA模式完胜，但DIA数据处理难度大。

iTRAQ采用数据非依赖性采集（Data-dependent acquisition, DDA），数据会有不全面性和随机性；Label free升级版采用DIA模式，数据相对完整，重复性好，但数据处理难度大。（图3）

图3 DDA vs DIA

DDA挑选一级谱中强度最强的20-30个离子进行二级质谱，母子离子对具备一一对应关系；

而DIA选择一定荷质比范围内全部的离子进行二级质谱碎裂，母子离子不具备一一对应关系。

DIA数据采集，依赖于质谱仪的扫描速度和分辨率，需配备高性能质谱仪（如Q Exective HF）；DIA模式的数据采集，会产生大量的数据，给分析带来很大困难，专业分析软件（如Spectronaut）才能处理这些数据。

通过DIA模式采集到的数据，可重复利用其进行分析，不会受限于时空差异；而DDA模式的数据，受限制比较大，一般不同时间不同地点采集到的数据，无法同时进行比较。

5、iTRAQ信号强度定量 V.S. Label free升级版二级质谱峰面积定量——Label free定量更准确。

iTRAQ根据二级质谱的标签断裂后的碎片信号强度进行定量，定量标准一致，但也存在降低二级肽段碎片信号的可能，影响鉴定效果；label free升级版根据肽段碎片的质谱峰面积进行定量（图4），定量依据更丰富，定量更准确。

图4 DIA定量方式

综上，科技君给大家总结一下，以下情况可优先选择iTRAQ：

1、实验组数低于8组（即同时比较的样本数≤8）

2、样本背景极为相似（相同物种和相同的样本类型）

3、经费有限，需要通过高性价比方案完成研究

更适合选择Label free升级版的情况：

1、实验组数高于10组

2、不同物种、不同来源或部位的样本，需要同时进行蛋白组分析和定量

3、需要区分样本中的“有无蛋白”

4、追求更精准的定性定量效果，避免标记和液相分组引入的实验误差

5、需要对采集的数据进行多次分析

一、iTraq(4、8标)或TMT(6、10标)标记蛋白组特点：

1、混合上机，平行性好。

2、经过分级，LC-MS分辨率高，效果更好。

3、性价比高。

二、label free蛋白组学特点：

1、没有标签数量限制，也不会因此引入实验误差。

2、DIA模式将全部离子二级碎裂，信息更全。

3、iTRAQ根据二级质谱的标签断裂后的碎片信号强度进行定量，label free升级版根据肽段碎片的质谱峰面积进行定量，定量依据更丰富，定量更准确。