文献摘要:越来越多的证据表明环状RNAs（circRNA）是在肿瘤发生中起重要作用。然而，circRNA在三阴性乳腺癌（TNBC）中的功能在很大程度上是未知的。作者使用circRNA微阵列来鉴定在TNBC细胞系中异常表达的circRNA。在TNBC细胞系和组织中通过定量实时PCR（qRTPCR）检测显着上调的circRNA的表达水平circGFRA1。采用Kaplan-Meier生存分析方法探讨circGFRA1在临床预后中的意义。然后通过细胞增殖，凋亡和小鼠异种移植试验检测了circGFRA1在TNBC中的功能。
此外，通过荧光素酶实验验证circGFRA1在TNBC中的miRNA海绵体功能。微阵列分析和qRT-PCR证实在TNBC中circGFRA1表达上调。 KaplanMeier生存分析显示，circGFRA1表达上调与存活率较差相关。circGFRA1的敲低抑制TNBC的增殖并促进细胞凋亡。通过荧光素酶实验检测表明到circGFRA1直接GFRA1和miR-34a结合。随后的实验表明，circGFRA1和GFRA1通过对miR-34a的海绵吸附作用调节彼此的表达。得出结论：circGFRA1可能作为竞争性内源RNA（ceRNA）吸附miR-34a调节GFRA1的表达以发挥调节TNBC生长的功能。 circGFRA1可能是诊断TNBC治疗的生物标志物和潜在靶点。
1、 circRNA GFRA1在TNBC中高度表达
为了研究TNBC中的潜在参与调控的circRNA，作者在三种TNBC细胞系（MDA-MB-231，MDA-MB-468和BT549）和一种HME细胞系（MCF-10A）上进行了高通量的circRNAs微阵列测定。筛选出10个上调的circRNA，并进行qRT-PCR以验证前8个上调的circRNA的表达，其中hsa_circ_005239在TNBC细胞中上调的最显著（下图），其来源于GFRA1基因，于是将其命名为circGFRA1。
2、circGFRA1敲低后抑制TNBC细胞的生长
作者接下来使用RNA干扰敲低circGFRA1的表达来评估其在TNBC中的生物学功能。 qRT-PCR分析表明抑制是成功的(下图A)，随后检测细胞增殖测定circGFRA1的下调会显著抑制TNBC细胞的生长（下图B），此外EdU检测显示在下调circGFRA1后，TNBC细胞的增殖潜力受损，在集落形成实验中，circGFRA1下调后，TNBC细胞集落形成能力显着降低（下图C）。
3、circGFRA1作为miR-34a的海绵吸附体
通过分别检测细胞质和细胞核中的circGFRA1，结果显示circGFRA1主要分布在TNBC细胞的胞质中（下图A），它可能作为一个ceRNA来结合miRNA，导致相应的miRNA靶靶标转录物的释放。
通过预测，在circGFRA1序列内发现miR-34a的潜在结合位点，因此作者进行萤光素酶报告基因检测以确定miR-34a是否可以直接与circGFRA1结合。qRT-PCR分析表明转染成功（下图B），当circGFRA1萤光素酶报告质粒和miR-34a mimics共转染时，荧光素酶强度降低超过40％，而当circGFRA1萤光素酶报告质粒和miR-34a 干扰共转染时，荧光素酶活性显著增强（下图C）。
qRT-PCR检测进一步证实miR-34a mimics可抑制circGFRA1的表达而miR-34a干扰会增加circGFRA1表达（下图D），在circGFRA1敲低时miR-34a的表达会上调（下图E）。数据证实circGFRA1在功能上与miR-34a相互作用，并作为miR-34a的海绵吸附体。
4、circGFRA1作为miR-34a的ceRNA调控GFRA1的表达
为了研究circGFRA1是否作为ceRNA吸附miR-34a并释放GFRA1的表达，作者继续检测GFRA1在乳腺癌细胞系和组织中的表达，结果显示GFRA1在TNBC细胞系中也上调（下图A）。
此外，使用TargetScan来鉴定miR-34a的假定靶基因，并预测GFRA1，为了证实这一发现，作者构建了含有全长GFRA1 3'-UTR的萤光素酶报道基因载体，其含有miR-34a和突变型的靶位点，与miR-34a mimics转染到MDA-MB-231细胞中。 当与miR-34a mimics共转染时观察到荧光素酶活性的显着降低，当用突变体荧光素酶质粒共转染时，荧光素酶活性没有显着差异。
相反，当与miR-34a inhibit共转染时观察到荧光素酶活性的显着增加（下图B）。qRT-PCR和WB验证了GFRA1的表达被miR-34a抑制（下图C），此外，miR-34a的表达被GFRA1抑制（图5g）。这些结果表明GFRA1是miR-34a的直接靶标，circGFRA1可以作为miR-34a的海绵吸附体解除其对GFRA1表达的抑制作用。
文献原文：RongfangHe,Peng Liu,Xiaoming Xie,et al. circGFRA1 and GFRA1 act as ceRNAs in triplenegative breast cancer by regulating miR-34a.J EXP CLIN CANC RES,2017,36:145