转录组拼接很难？一文读懂转录组拼接，实战教学

    lz从今天开始希望跟大家分享一些生信的实战，希望与大家一起进步，前段时间应老板的要求自学的转录组的拼接原理，经过一番折腾，最终在超算平台的帮助下完成了老板交给的任务。

   转录组是细胞内所有转录产物的集合，包括信使RNA、核糖体RNA、转运RNA及非编码RNA，随着二代三代测序技 术的发展，大量的reads被鉴定出来，目前最常用的转录组组装软件是Trinity。下面详细介绍trinity转录组装的原理和操作步骤。

Trinity，是由 the Broad Institute 开发的转录组denovo组装软件，由三个独立的软件模块组成：Inchworm, Chrysalis和Butterfly。

Trinity，是由 the Broad Institute 开发的转录组denovo组装软件，由三个独立的软件模块组成：Inchworm, Chrysalis和Butterfly。三个软件依次来处理大规模的RNA-seq的reads数据。

Trinity的简要工作流程

Inchworm

将RNA-seq的原始reads数据组装成Unique序列；

Chrysalis

将上一步生成的contigs聚类，然后对每个components构建deBruijn图；

Butterfly

处理这些deBruijn图，依据图中reads和成对的reads来寻找路径，从而得到具有可变剪接的全长转录子，同时将旁系同源基因的转录子分开。

简单介绍了Trinity的组装原理，下面开始组装

前期的准备，Linux操作系统和基础的Linux操作，这一步不再写，进行到转录组组装这一步肯定有Linux基础，注意配置临时的环境变量

1、使用软件 khmer 进行标准化

https://www.jianshu.com/p/cd7f83f65387

2、在得到left、right这两个fastq文件后就可以进行组装了

首先在Linux下安装Trinity

进入官网，下载Trinity到你的安装目录，解压，进入解压目录，make

下载：nohup wget -c https://github.com/trinityrnaseq/trinityrnaseq/archive/Trinity-v2.4.0.tar.gz 

解压：tar -zxvf Trinity-v2.4.0.tar.gz

cd Trinity-v2.4.0

编译：make

安装成功如图：trinity是perl语言编写的，测试安装成功运行perl+trinity路径，成功如图所示，有trinity的基本用法介绍

trinity参数介绍

2. Trinity参数  原文引用http://blog.sciencenet.cn/blog-1469385-1038291.html

必须的参数： --seqType reads的类型：(cfa, cfq, fa, or fq) --JM jellyfish使用多少G内存用来进行k-mer的计算，包含‘G’这个字符 --left 左边的reads的文件名 --rigth 右边的reads的文件名 --single 不成对的reads的文件名 可选参数： Misc： --SS_lib_type reads的方向。成对的reads: RF or FR; 不成对的reads : F or R。在数据具有链特异性的时候，设置此参数，则正义和反义转录子能得到区分。默认 情况下，不设置此参数，reads被当作非链特异性处理。FR: 匹配时，read1在5'端上游, 和前导链一致, read2在3'下游, 和前导链反向互补. 或者read2在上游, read1在下游反 向互补; RF: read1在5'端上游, 和前导链反向互补, read2在3'端下游, 和前导链一致; --output 输出结果文件夹。默认情况下生成trinity_out_dir文件夹并 将输出结果保存到此文件夹中。 --CPU 使用的CPU线程数，默认为2 --min_contig_length 报告出的最短的contig长度。默认为200 --jaccard_clip 如果两个转录子之间有UTR区重叠，则这两个转录子很有可能在 de novo组装的时候被拼接成一条序列，称为融合转录子(Fusion Transcript)。如果有 fastq格式的paired reads，并尽可能减少此类组装错误，则选用此参数。值得说明的是： 1. 适合于基因在基因组比较稠密，转录子经常在UTR区域重叠的物种，比如真菌基因组。而对 于脊椎动物和植物，则不推荐使用此参数; 2. 要求fastq格式的paired reads文件(文件 中reads名分别以/1和/2结尾，以利于软件识别)，同时还需要安装bowtie软件用于reads 的比对; 3. 单独使用具有链特异性的RNA-seq数据的时候，能极大地减少UTR重叠区很小的 融合转录子; 4. 此选项耗费运算，若没必要，则不用此参数。 --prep 仅仅准备一些文件(利于I/O）并在kmer计算前停止程序运行 --no_cleanup 保留所有的中间输入文件 --full_cleanup 仅保留Trinity fasta文件，并重命名成${output_dir}. Trinity.fasta --cite 显示Trinity文献引证和一些参与的软件工具 --version 报告Trinity版本并推出 Inchworm 和 K-mer 计算相关选项： --min_kmer_cov 使用Inchworm来计算K-mer数量时候，设置的Kmer的最小值。 默认为1 --inchworm_cpu Inchworm使用的CPU线程数，默认为6和--CPU设置的值中的 小值。 Chrysalis相关选项： --max_reads_per_graph 在一个Bruijn图中锚定的最大的reads数目，默认为200 000 --no_run_chrysalis 运行Inchworm完毕，在运行chrysalis之前停止运行 Trinity --no_run_quantifygraph 在平行化运算quantifygrahp前停止运行Trinity Butterfly相关选项： --bfly_opts Butterfly额外的参数 --max_number_of_paths_per_node 从node A -> B,最多允许多少条路径。默认 为10 --group_pairs_distance 最大插入片读长度，默认为500--path_reinforcement_distance 延长转录子路径时候，reads间最小的重叠碱基 数。默认PE:75; SE：25 --no_triplet_lock 不锁定triplet-supported nodes--bflyHeapSpaceMax 运行Butterfly时java最大的堆积空间，默认 为20G --bflyHeapSpaceInit java初始的堆积空间，默认为1G --bflyGCThreads java进行无用信息的整理时使用的线程数，默 认由java来决定 --bflyCPU 运行Butterfly时使用的CPU线程数，默认为2 --bflyCalculateCPU 计算Butterfly所运行的CPU线程数，由公式 80% * max_memory / maxbflyHeapSpaceMax 得到 --no_run_butterfly 在Chrysalis运行完毕后，停止运行Butterfly Grid-computing选项： --grid_computing_module 选定Perl模块，在/Users/bhaas/SVN/trinityr naseq/trunk/PerlLibAdaptors/。

3、 适合于illumina测序数据的真菌物种转录组组装的Trinity命令为：

Trinity.pl --seqType fq --JM 50G --left reads_1.fq --right reads_2.fq --SS_lib_type FR --output transcriptome_tissue --CPU 24 --jaccard_clip --inchworm_cpu 24 --group_pairs_distance 500 --bflyCPU 24

（trinity需要java1.8以上版本支持，如果提示版本过低，请跳过版本检查，如果是自己的电脑请忽略直接安装java的更高版本）

4、运行结束以后，得到我们需要的faster文件