为什么我的基因富集不到某个看似明显的通路?

刘小泽写于2020.1.23

遇到的问题

就是常规的差异分析结果进行GO富集分析,代码是:

# 先获得差异分析结果DEG_mtx,然后按照log2FC排序
geneList <- DEG_mtx$log2FoldChange
# 这一步是去掉Ensemble ID的版本号,因为后面进行ID转换时,Ensemble ID是不支持版本号的
names(geneList) <-  str_split(rownames(DEG_mtx) ,
                                  pattern = '\\.',simplify = T)[,1]

geneList <- sort(geneList,decreasing = T) 

得到了这个背景基因集(universe gene list)之后,就可以进行富集分析

library(org.Hs.eg.db)
up_BP <- enrichGO(gene          = up.gene,
                      universe      = names(geneList),
                      keyType       = 'ENSEMBL',
                      OrgDb         = org.Hs.eg.db,
                      ont           = "BP",
                      pAdjustMethod = "BH",
                      pvalueCutoff  = 1,
                      qvalueCutoff  = 1,
                      readable      = TRUE)
# 如果不用参数readable= TRUE,也可以使用设置up_BP富集分析结果的基因显示为Symbol ID
up_BP <- setReadable(up_BP, OrgDb = org.Hs.eg.db)
tmp <- as.data.frame(up_BP)

比如我关注:GO:0030154 (cell differentiation)这个通路,放在数据框中查找,结果却是空的

思考

按说这个通路应该是很大的,不应该找不到这个通路的。

首先查询这个通路

注意这个链接的特点,以后可以快速查找: https://www.ebi.ac.uk/QuickGO/term/GO:0030154

看到这个图,它也的确是在子节点,属于BP通路:

为什么我的基因富集不到某个看似明显的通路?_第1张图片

那么这个通路到底有多少基因呢?

刚开始想从网页直接查询,但几分钟都没有查到。然后突然想到,不是有org.db这个强大的R数据库吗,而且之前也写过如果去获取其中的信息:如何快速理解GO富集结果?

library(org.Hs.eg.db)
go2gene <- toTable(org.Hs.egGO2ALLEGS)
uni_gene <- unique(go2gene$gene_id[go2gene$go_id == 'GO:0030154'])
> length(uni_gene)
[1] 4239

这个通路竟然有4000多个基因

我们的差异基因有多少在这个通路呢?

# 我们总共有这些基因,但它们是Ensemble ID,而uni_gene是Entrez ID,需要转换一下
> length(up.gene)
[1] 1445
trans_id <- bitr(up.gene,fromType = "ENSEMBL",toType = "ENTREZID",
                 org.Hs.eg.db)

然后找二者交集

> length(intersect(trans_id$ENTREZID,uni_gene))
[1] 231

发现虽然我们这个通路有4000多个基因,但我们的1000多个差异基因中,也有200多个属于这个通路。因此不会不存在这个通路的

那么问题出在哪里?

我又看了一下enrichGO的参数,终于发现,原来它对GO term的基因数量做了限制:

为什么我的基因富集不到某个看似明显的通路?_第2张图片

它默认使用基因数量10-500的term进行富集分析,而我们这里的这个通路,由于基因数量4000多,所以不被纳入考量

因此,如果真的要看这个通路,那么只需要修改一下参数:

up_BP2 <- enrichGO(gene          = up.gene,
                      universe      = names(geneList),
                      keyType       = 'ENSEMBL',
                      OrgDb         = org.Hs.eg.db,
                      ont           = "BP",
                      pAdjustMethod = "BH",
                      pvalueCutoff  = 1,
                      qvalueCutoff  = 1,
                      readable      = TRUE,
                            minGSSize = 10, maxGSSize = 5000)
tmp2 <- as.data.frame(up_BP2)

也可以看到结果比之前多了几百个通路富集【当然这里没进行任何的过滤,因为可以事后再过滤】

然后就能看到,这个通路出现了,并且还很比较显著:

关于事后过滤

这个Y叔早已经多次介绍过了,并且很好用:https://wemp.app/posts/8ee2f29e-107d-4844-9c5c-7577ea3a1105
不过需要使用enrichplot的开发版

它的目的就是输出的富集分析结果作为数据框,然后自己过滤,最后把结果再转换为enrichResult对象,进行后续作图,例如:

x=up_BP
y = x[x$pvalue < 0.05, ]

> dim(x);dim(y)
[1] 4692    9
[1] 549   9

> class(y)
[1] "data.frame"

然后只需要加个参数:asis=T

y = x[x$pvalue < 0.05, asis=T]
> class(y)
[1] "enrichResult"
attr(,"package")
[1] "DOSE"

这样就完成了自行过滤,并且保持了原来的数据格式


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