老板就是上帝
上帝说要有光，于是就有了光
导师说要有可视化结果，于是我努力把结果可视化~
前情提示
为了知道测序reads中污染物的来源，我们之前学习使用了blast，甚至为了追求速度，我们进一步学习使用了blat和diamond。
做完这些分析之后，我们需要自己去统计，再去可视化（一切都是为了让老板的体验更佳）。
但是，一次寻找public data的过程中，我偶然间发现NCBI对于上传的数据也有自己的taxonomy analysis。NCBI使用一个名为NCBI SRA Taxonomy Analysis Tool (STAT)的官方软件进行分析，其结果也可以直接用于Krona进行可视化
接下来，我们随便找个数据分别看一下软件的运行结果以及可视化结果
其中可视化结果中，从内到外，分别是界门纲目科属种。而绿色部分表示那些没有识别出的部分。
STAT (NCBI SRA Taxonomy Analysis Tool)
对于STAT的运行结果，它给出了数据中reads在不同分类节点上的百分比，若一个reads可以同时比对到超过两个分类节点，则这个reads被划分到分类层级最低的共享分类中。比如，当一个read映射到属于同一属的两个物种时，它被分配在属这个分类层级。
当一个reads可以比对到一个物种的多个子分类时，那么高分类层级的占比通常高于低层级分类的占比。
STAT的分类方法，类似于blast，将参考基因组库，按照k-mer建立索引，然后将reads进行比对/query。接着将比对上的reads进行分类，计算百分比。
STAT的下载安装相当复杂（似乎尚不支持conda安装），以下是具体代码：
mkdir ~/SRC ; cd ~/SRC
git clone https://github.com/ncbi/ngs.git
git clone https://github.com/ncbi/ncbi-vdb.git
git clone https://github.com/ncbi/ngs-tools.git
cd ngs/ngs-sdk ; ./configure -p=~/NCBI && make
cd ../../ncbi-vdb ; ./configure -p=~/NCBI && make
cd ../ngs-tools ; ./configure -p=~/NCBI
具体用法可以参考示例文件，在 examples 文件夹里有一些shell脚本
参考资料
- https://github.com/ncbi/ngs-tools
Krona
Krona可以让我们对分类数据进行可视化，得到的数据结果可以放大缩小，既可以通过excel插件绘制可视化结果也可以使用KronaTools软件包。它生成的可视化图是交互式的，可以自行调整展示方式。
下载安装
这里我们以KronaTools为例介绍Krona的使用，首先我们下载软件包：
wget -c https://github.com/marbl/Krona/archive/v2.7.1.tar.gz
tar -zxvf v2.7.1.tar.gz
cd /Krona-2.7.1/KronaTools
mkdir taxonomy
./install.pl --prefix $PWD --taxonomy $PWD
# 此处在--prefix后不需要加bin，会自动在路径下生成一个bin目录
-
--prefix指定bin目录所在的路径 -
--taxonomy指定updateTaxonomy.sh或updateAccessions.sh这两个脚本运行时，得到的taxonomy（物种分类）文件所存储的位置
Krona中的一些工具依赖于NCBI taxonomy，要想正确使用，需要运行当前路径下的 updateTaxonomy.sh 脚本。该脚本下载一个本地的taxonomy数据库，不到100M。也可以使用该脚本进行NCBI taxonomy数据库的更新。
此外，还有一些工具依赖于accession 和 taxonomy ID之间的转换查找，因此需要运行 updateAccession.sh 脚本，安装本地的accession-to-taxonomyID数据库，该数据库较大，约16GB。
除了在安装过程中，进行数据库的下载外，也可以进行手动下载，后续再进行配置。具体方式见Krona的github(https://github.com/marbl/Krona/wiki/Installing)
具体使用
Krona支持多种输入文件格式，我最常用blast进行比对，因此以blast的输出结果进行举例。在Krona的安装目录下存在一个 ktImportBLAST 脚本，它可以直接利用blast输出结果产生可视化网页。具体脚本如下
cd ./bin
./ktImportBLAST /test_path/test.blast.out -o /test_path/test.blast.html
-
-o参数指定输出的结果文件名称，若需要分类的reads数目过多，则Krona会新产生一个同名文件夹存放这些额外信息。
其他的输入文件格式此处不再展开讲，具体可参考软件github主页（https://github.com/marbl/Krona/wiki/KronaTools）