文献阅读-Pup技术助力蛋白相互作用的研究

    跨膜蛋白和膜停留蛋白占据了人类蛋白组的30%以上，对于细胞间的通讯来说非常重要，准确来说主要是依赖定位于细胞膜上的受体。但是目前传统的通过标签拉蛋白在通过质谱鉴定对于膜蛋白来说并不是很奏效，这可能是由于膜蛋白疏水的特性以及提取条件可能会应道蛋白的互作，以及膜蛋白和相互作用的蛋白瞬时的相互作用，并且膜脂质定位的PPI因为脂双分子层的丢失可能会被miss掉。近年来基于一些近邻标记的系统例如BioID以及APEX已经被用来鉴定蛋白的相互作用，这些技术往往是将自己感兴趣的蛋白与一个临近标记的酶融合当存在生物素或是包含生物素的底物，这种融合酶就会被激活然后释放底物去标记蛋白，因此一些临近的蛋白就会被酶催化带上标记。这些酶往往是一些改造过的连接酶或是过氧化物酶。当利用这种标签系统研究细胞质内的PPI时，通常会和定量性的质谱连用来找相互作用的伙伴。另外一种基于临近标记的策略就是NEDDylator系统，通过融合一个NEDD8共价连接酶，这样目的蛋白就会被NEDD8所贴上泛素化标签，但是这种方法依赖内源的NEDD8途径。这篇文章开发了一种全新的系统称为PUP-IT，利用细菌的类泛素蛋白Pup蛋白和Pup的连接酶pafA，Pup是一个很小的细菌蛋白，一共只有64个aa并且C端存在一个Gly-Gly-Gln的序列，在细菌中C末端的Gln会先脱氨形成Glu，当存在ATP的时候，Pup连接酶PafA会催化Glu的磷酸化，这样C末端的Glu均能够共价连接到靶标蛋白Lys残基的侧链上，因此lys的ε -amino group对于反应来说是必要的。

     首先他们先对Pup修饰的序列进行比对发现并无除了Lys以外的一致性序列，因此Pup特异性的调控Lys残基的修饰。为了进一步证明PafA能够作用于靶标的lys，作者将PafA连接到没有底物的蛋白上GST的N端或是XIAP的C端，将这些蛋白打质谱鉴定发现，GST的确是带了额外的修饰，被修饰的Lys主要均匀的分布在GST的表面。随后他们查看PafA介绍的蛋白标记是否是基于近邻的方法，他们讲PafA和自由的GST混合在一起，查看非特异性的标记，在PafA高浓度时会自我修饰，但是很少能观察到GST的修饰，这与PafA激活和连接的机制相同，PafA可能作为一个很好的近邻标记酶，这种酶可以广泛识别底物并且带有高特异性，因为激活的中间体Pup不能够从酶附近自由扩散。

    随后他们检测了不同形式的Pup能否作为PafA的底物发挥功能，Pup的N端带有各样的修饰也不会丢失功能，同时64个aa的Pup还能够被截短成更小的肽段，最小的话是D37到E64(命名为DE28)，仍能够共价连接上靶标的Lys，此外他们还将将细菌来源的羧化酶结构域融合到Pup(E)上，使其在细胞中被生物素修饰。于是作者构建了羧肽酶融合PupE(bio-PupE)y以及生物素融合的DE28(bio-DE28）用于下面分析

首先他们先对Pup修饰的序列进行比对发现并无除了Lys以外的一致性序列，因此Pup特异性的调控Lys残基的修饰。为了进一步证明PafA能够作用于靶标的lys，作者将PafA连接到没有底物的蛋白上GST的N端或是XIAP的C端，发现在PUP存在的情况下，会出现阶梯状的条带，暗示着蛋白受到了自我修饰，接下来，他们首先检测了Pup-it这个技术能否检测较弱的PPI，于是他们选择了一个SPOP MATH domain，SPOP是Cul3泛素酶的一个亚基，可以与多个蛋白结合且存在不同的亲和力。作者使用四个不同小肽作为bait与Paf1融合，检查GST-MATH或是His-MATH的修饰情况，发现哪怕是亲和力最低的pep3均能够检测到MATH的修饰。为了研究这套系统是能够在细胞内发挥功能，作者将PUP-ITpep 和 MATH共转染，发现MATH-MYC也能够进行额外的修饰，暗示着这套系统在细胞内也能够很好的发挥工作。尽管MATH和特异小肽直接的相互作用力较小，Pup的修饰仍然特异性依赖于MATH和小肽的相互作用，作者合成了WT的pep1和pep1m，随着外源施加pep1，MATH的修饰水平不断增加，但是外援施加pep1m时则不会，暗示着小肽和受体的结合对于Pup(E)的修饰至关重要。

Pup-IT能够检测蛋白间的弱相互作用

随后作者具体尝试了PUP-IT的几种用法，例如鉴定与CD28相互作用的蛋白，CD28是定位T细胞表面的受体，能够接受配体CD80/86的信号来激活T-细胞。在先前的研究过程中p85, LCK 和 ITK这一个蛋白均已证明能够与CD28的胞质侧相结合。于是作者将CD28的胞内侧与PafA相融合，作为对照作者还加入了没有尾部的CD28（1-178aa），以及短胞质侧的CD28(3aa，1-184),p85结合缺陷的的突变体(Y191F),LCK结合缺陷的的突变体(Y209A),在WT和Y209A中能够检测到p85蛋白。为了鉴定其他全新的与CD28结合的蛋白，作者共转染Jurkat细胞PUP-ITCD28和生物素标记的Pup，提蛋白过链霉亲和素，打质谱，鉴定蛋白，还是一些作为control的材料做差异表达，发现鉴定到的这些材料中不仅有前面存在已经鉴定到的结合蛋白，还有一些全新的成员，

PUP-IT可以用于鉴定跨膜蛋白的胞质侧结合蛋白

通过质谱鉴定胞质互作蛋白

为了鉴定细胞表面与CD28相互作用的蛋白，对于bio-Pup作者使用了TET-ON系统诱导表达，发现存在41个蛋白高表达，包含已知的相互作用蛋白LCK, ITK 和 p85，在主要被拉出来的蛋白中主要被注释为四类CD28 signaling, cytoskeletal remodeling, protein folding processing 和 vehicle transport，值得注意的是这些蛋白中很大一部分是GTPases 和 GTPase regulators，并且拉出来的这些蛋白带有Lys修饰主要是在蛋白表面。

CD28主要结合的因子

接下来作者想用这套系统来标记CD28的配体细胞，为了避免PafA长期在细胞表面，作者利用了一套雷帕霉素的诱导系统，能够诱导FKBP 和 FRB源二聚化，其中PafA -FRB, 而FKBP插入与CD28信号肽后，在加入雷帕霉素后，使用链霉亲和素的荧光染色可以明显揭示在细胞外的荧光。随后作者使用这套系统+SEE(一种抗原肽)对于Raji参与主要组织相容性以及Jurkat T细胞受体非常重要，但是并不影响CD28 和 CD86 以及 CD28 和 CD80结合。当SEE存在的时候，能够促进Jurkat T cells 和 Raji B cells的结合，检测生物素化，B细胞能够检测到生物素化，且没有一个GFP的B细胞能够被生物素化，也说明B细胞上结合蛋白的生物素化依赖于两个细胞相结合。

PUP-IT在细胞表面的组装

另外最大的问题就是找受体的配体，作者利用雷帕霉素系统研究了细胞因子 IL-2 和 IL-2 receptor subunit CD25，CD25一般被激活后才能被检测到，作者首先激活了T细胞，再在细胞培养物中加入IL-2–FKBP, FRB–PafA, bio-DE28以及雷帕霉素，发现仅有T细胞被激活的marker基因CD69表达后，细胞表面的生物素化程度上升，而通过体外共转染能够检测到直接调控CD25的生物素化。为了说明细胞表面的标签能够直接被IL-2和CD25结合所调控，于是作者将IL-2–FKBP过量加入，发现细胞表面的修饰数目更多，并且如果进一步加入IL-2的话，可以竞争性降低细胞表面的修饰，因此小肽PafA的修饰能够诱导受体的生物素化。

PUP-ITIL2可以介导受体标记