基因工程鼠概述

1. 转基因小鼠

• Tg表示转基因（transgene），细分如下：
  1. TgH：同源重组，
  2. TgR：经逆转录病毒载体感染的插入，
  3. TgN： 非同源插入。
     转入的基因放在圆括号中，不用斜体
转入报告基因或者重组酶系统（例如，GFP，lacZ，cre）时，因表达的组织特异性不同，应该在转入基因前表示启动子，比如Tg(Zp3-cre)

1.1 一般转基因鼠

图片来自赛业公众号

TdTomato大鼠：（SD-Gt(ROSA26)tm1(CAG-LSL-Tdtomato)/Bcgen）
# SD大鼠-Rosa26位点-【启动子-LSL-目的基因】-来自百奥赛图。

ROSA-启动子-((loxp-membrane TdTomato - polyA- loxp）-（membrane eGFP-polyA))
ROSA-pCA-     loxp-mT-pA-loxp                      -  mG-pA
## mTmG小鼠，Cre重组前能够在膜上发出红色荧光，而被Cre重组后则在膜上发出绿色荧光

1.2 Cre工具鼠

一般采用原位敲入（KI）技术，将Cre基因组敲入特定启动子之后。
根据位置不同又分为两类：
①将Cre基因敲入启动子的第一个起始密码子之后；插入起始密码子之后的Cre蛋白表达量较高，但可能影响后续蛋白表达；
②将Cre基因敲入启动子后续蛋白的终止子之前；终止子之前插入的Cre蛋白表达量相对较低，但不会影响蛋白正常表达。

• creER： 为cre重组酶与雌激素受体融合而成，可被tamoxifen激活。如曾经的内皮Cre：MGI:3848982：Tg(Cdh5-cre/ER)1Rha【或写作 Cdh5(PAC)-CreERT2】

1. Cdh5: Cadherin 5, type 2 or VE-cadherin (vascular endothelial cadherin) also known as CD144 (Cluster of Differentiation 144), is a type of cadherin. It is encoded by the human gene CDH5.
2. The tamoxifen-inducible cre/ERT2 sequence was inserted into a PAC (Phage1 artificial chromosome) containing the VE-cadherin gene to generate the transgene construct.
3. Rha: provided by Ralf H Adams.

• CreER：CreER的改进版，T2上标。

通过三个点突变改造ER（estrogen receptor,人类雌激素受体），使之不能结合雌激素，只能结合其类似物（Tamoxifen的代谢产物4-OHT），然后进核发挥Cre重组酶活性，进而增强了对cre酶功能的调控。

附Cre诱导方法。

2. 定点修饰小鼠

• tm（targeted mutation）：利用ES打靶技术构建的小鼠
• em（endonuclease-mediated mutation）：核酸内切酶系统（如CRISPR/Cas9）介导的基因修饰。
  修饰方式上标。
被定点修饰的基因：用基因符号表示，需要斜体

tm：ES细胞同源重组技术

原理 利用Cre-Loxp系统对目的基因进行可诱导表达调控，当两个Loxp位点位于同一染色体上且方向一致时，Cre重组酶会特异性的将两个Loxp位点间的序列切除。构建Rosa26-(SA /pCAG)-loxp-Stop-loxp（LSL）-cDNA-pA打靶载体，转入ES细胞，获得在Rosa26目的位置发生正确同源重组的ES克隆，并将其注射到小鼠囊胚内细胞团，获得嵌合鼠，通过与野生型小鼠繁殖得到正确同源重组ES细胞来源的Knockin小鼠。Knockin小鼠可与各类表达Cre重组酶的小鼠杂交，获得组织特异性表达的小鼠模型。

em： Crispr/Cas9技术

原理 根据Rosa26基因序列设计合成sgRNA，构建含同源序列和目的序列的片段，与Cas9核酸酶mRNA共同注射到小鼠受精卵胞质，Cas9 mRNA、sgRNA与基因组靶序列结合并切割双链DNA，以含目的片段的同源序列为模版修复基因组DNA，最终获得在Rosa26基因intron中定点插入片段的小鼠。

Rosa26

• ROSA26（Gt(ROSA)26Sor）是6号染色体上的一个安全区域，本身是一个反义长链非编码RNA基因，已被证明在大部分组织和细胞中都有表达。
• 外源性的基因定点插入这个位点不会影响其他基因的表达。20 世纪 90 年代末 由Philipe Soriano 及其同事发现(pnas.94.8.3789)。

Gt: gene trap
β-gal: β-galactosidase，经典的报告基因。
β-geo：另一个报告质粒，融合了gal和neo， Genes & Dev. 1991. 5: 1513-1523 。

2.1 基因中插入基因

• 基因敲入小鼠需要标出转入基因，放圆括号中，上标。

  
  
  

  En1基因编码区被Otx2基因取代。图片发自赛业公号

IRES（Internal ribosome entry site,内部核糖体进入位点）序列
能招募核糖体对mRNA进行翻译。
将IRES与外源cDNA融合，发现IRES能独立地起始翻译。
IRES不仅存在于RNA病毒中，在很多DNA病毒中也频繁出现，且在哺乳动物、植物以及酵母中均发现了IRES序列存在，但不同的IRES在功能机理上有一定差异。

2.2 基因敲除

类比可知。

2.3 基因修饰：如flox系统

• Flp/FRT系统，约等于Cre／loxP系统在真核细胞内的同源系统。
• FRT(Flp recognition target)
• 这两个系统比较明显的区别是它们发挥作用的最佳温度不同，Cre重组酶发挥作用的最佳温度为37℃，而Flp重组酶为30℃。因此，Cre／loxP系统最适宜在动物体内使用。

Appendix：Jax小鼠命名规则

JAX小鼠命名规则.jpg