运用CRISPR/Cas9技术对斑马鱼进行基因敲除

基因编辑可以分为三代，第一代:ZFN;第二代:TELEN;第三代:CRISPR/Cas。CRISPR（Clustered regularly interspaced short palindromicrepeats）规律成簇间隔短回文重复；Cas9（CRISPRassociated nuclease）是CRISPR相关核酸酶，CCRISPR/Cas9是最新出现的一种由RNA指导的，利用Cas9核酸酶对靶向基因进行编辑的技术。

目前CRISPR/Cas9系统已经广泛用于对哺乳动物细胞、斑马鱼、小鼠、猪、猴等不同动物、拟南芥、水稻、小麦、玉米、大豆等不同植物，以及病毒、细菌与真菌等不同有机体的基因组编辑。

在运用CRISPR/Cas9技术研究的鱼类中，斑马鱼 (Danie rerio)是被研究得最多的对象。

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2013年，美国Joung教授实验室首次将Cas9系统应用于斑马鱼基因组编辑的研究，实现了对基因组的靶向操作，在特定基因位点处产生了碱基缺失和插入的不同形式的突变(Hwang et al., 2013)。

北京大学熊敬维教授实验室几乎在同一时间报道了运用Cas9系统对斑马鱼中etsrp基因和gata5基因进行了特定的基因敲除 (Chang et al., 2013)。

北京大学张博教授实验室通过设计一对Cas9位点，实现了大片段DNA (上百个到百万个碱基) 的剪切或倒置 (Xiao et al., 2013)。Schmid实验室的研究表明，在Cas9显微注射的受精卵中，有11%~43%能够发育成为F0，产生稳定的突变品系 (Hruscha et al., 2013)。

上海海洋大学海洋科学学院运用CRISPR/Cas9技术成功敲除了斑马鱼hae3基因，并且研究结果发现，胚胎时期hae3基因的缺失会严重影响斑马鱼血红蛋白的生成，而且伴随畸形发育表型 (蔡畅等, 2015)。

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上海海洋大学水产与生命学院利用CRISPR/Cas9敲除斑马鱼细胞周期蛋白M2(CNNM2)基因，获得了能稳定遗传的CNNM2基因敲除斑马鱼个体，为进一步研究CNNM2基因和机体镁离子稳态之间的关系打下了基础 (黄振玉等, 2015)。

敲5除斑马鱼kctd1基因0，发现kctd10突变个体的房室管畸形，产生一个拉长的线状的心脏 (张绪帅, 2016)。

重庆医科大学基础医学院运用CRISPR/Cas9技术敲除斑马鱼faf1基因，得到杂合突变型斑马鱼，并观察到该杂合突变型个体有体细胞色素沉积延迟，受精后第4天开始尾部肌节出现“结节样”表型以及头颅缩小、舌骨小角角度增大等颅面软骨畸形的变化，并于受精后8~9 d 死亡(刘菁等, 2017)。

湖南师范大学利用CRISPR/Cas9系统成功敲除斑马鱼fhl1a基因，并证明fhl1a基因突变能稳定地遗传到下一代个体，为进一步研究fhl1a基因在心脏发育中的具体调控机制打下基础 (陈思行等, 2017)。

首都医科大学附属北京同仁医院内分泌科成功构建了rfx6基因敲除斑马鱼动物模型，初步研究发现rfx6纯合突变体生长发育迟滞、体型瘦小、呈现糖尿病消瘦体型并且不能产生后代，得出结论：rfx6在斑马鱼胰腺的发育中占据重要地位，是控制斑马鱼胰腺发育的关键因子 (程呈等, 2015)。

同济大学生命科学与技术学院利用CRISPR/Cas9构建了稳定遗传的斑马鱼WHSC1L1纯合突变体，为研究胚胎发育过程中由此基因突变引起的组蛋白甲基化修饰变化对胚胎发育的影响及机制提供了有力的帮助 (陈韵如, 2016)。

作为优选的模式脊椎动物，斑马鱼模型可以用来评价人类基因的作用与功能、解析其在遗传与发育上发挥作用的分子机制。通过基因组改造（基因敲除、敲入和转基因等）构建人类疾病的斑马鱼模型，表型模拟人类疾病的病症，进而用于研究分子遗传病的病理机制、筛选治疗疾病的化学药、开发基因治疗的生物药等生物医药的研发。

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