不同的CRISPR系统

原创： 赛诚生物 赛诚生物 2018-01-19

CRISPR系统的脱靶效应一直是备受关注的问题，科研工作者们为改善其脱靶效应及其他相关问题，致力开发不同的CRISPR系统。本文主要从CRISPR-Cas9 突变体系统（Cas9Nickase、dCas9）、其他的CRISPR系统（saCas9, and Cpf1 核酸酶）两方面为你介绍不同的CRISPR系统。

一、CRISPR-Cas9 突变体系统

（1）Cas9Nickase

CRISPRCas9技术的潜在脱靶效应可能是由Cas9核酸酶活性引起的。 为了改善由Cas9核酸酶活性引发的脱靶效应，开发了Cas9 Nickase。

Cas9 Nickase是Cas9的突变形式， 是由RuvC1和 HNH两个核酸酶活性区域中其中一个核酸酶活性区域突变而成。 这种突变形式产生单链缺口而不是在靶位点的双链断裂。

利用Cas9 Nickase进行基因组编辑，需要两个gRNA而不是一个。 两个gRNA将被设计在相反的DNA链上且紧密接近（序列相距不超过20bp），以确保一旦两条链被Cas9 Nickase切割时，就会产生DNA双链断裂。

这种配对的Cas9 Nickase减少了脱靶效应，因为两个gRNA需要一起作用才能产生DNA的双链断裂（图7）。一旦双链DNA断裂，NHEJ或HDR路径将被激活以完成基因组编辑过程。

Figure1

Figure1 – The Cas9 nickase is a mutant form of the Cas9 nuclease where one of itscleavage domains has been disabled. Using Cas9 Nickase, off-target effects ofthe wild type Cas9 can be minimize, since the nicks in the DNA rarely lead toInDel mutations.

Figure2

Figure2 – When using paired Cas9 nickases additionalconsiderations need to be given to the gRNA design. These include producing a5’ overhang, the spacing between the two gRNAs, and the relative position ofthe two gRNA target sites.

（2）dCas9

dCas9的英文为dead Cas9，即Cas9的RuvC1和 HNH两个核酸酶活性区域同时发生突变。因此，dCas9只保留由gRNA引导进入基因组的能力，剪切酶活性全部消失。

dCas9主要是与其他效应蛋白融合（如GFP、转录因子、组蛋白修饰等），进行基因调控，基因组成像，染色质或DNA修饰以及染色质免疫沉淀等。

Figure3

Figure3– The Cas9 null mutant has lost both of its DNA cleavage domains while stillretaining its ability to target genomic loci through gRNA:DNA interactions. Byfusing effector domains to the Cas9 null mutant, it is possible to activategene expression (i.e. V964 or NF-kB), repress gene expression (i.e. KRBAdomain), visualize genomic loci (i.e. EGFP), perform chromatin remodelling(i.e. TET proteins), and simplify chromatin immunopercipitation (through anantibody epitope tag)

二、其他的CRISPR系统-：saCas9, and Cpf1 核酸酶

为了解决spCas9的局限性，即其大尺寸和富含G的PAM序列，已经研究出几种 CRISPR酶作为潜在替代物，最显着的是Cpf1和saCas9。故我们总结了spCas9，saCas9和Cpf1之间的一些重要差异和相似之处，详细见下表。

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（1）Cpf1核酸酶

2015年末，麻省理工学院的张峰小组发现了一种新的CRISPR核酸酶Cpf1。Cpf1可以识别富含T的PAM基础，与富含G的PAM -Cas9相比，这显着扩大了基因组靶标的广度。因此，Cas9是富含G的基因组区域的首选核酸酶。

而 Cpf1主要用于靶向富含T的基因组与Cas9相比，Cpf1的gRNA更短一些， Cas9的gRNA是约100nt的tracrRNA / crRNA杂合体，而Cpf1的gRNA是仅有42nt的 crRNA。这将gRNA的大小减少了一半以上，同时也简化了与合成和化学修饰相关的方法和节约了成本，也使得Cpf1成为复合基因组编辑的最佳选择，即可将多个gRNA插入同一载体并进行同步基因编辑。

Cpf1切割位于PAM位点下游18-23bp的DNA， NHEJ修复断裂的双链DNA后识别序列不中断。因此，Cpf1能够进行多轮DNA切割，增加了产生基因组编辑的机会。相比之下， Cas9在PAM位点上游3bp切割，NHEJ修复双链DNA后识别序列会被破坏。

（2）saCas9核酸酶

saCas9从金黄色葡萄球菌中分离的微型Cas9核酸酶。

SaCas9比spCas9小约1kb，这使其能够更有效地包装进较小容量的腺病毒（AAV）中，为调节元件，crRNA和tracrRNA留下额外的空间。也使得将Cas9与gRNA构建到一个载体上成为可能，称为All-In-One载体。

spCas9识别5'-NGG-3'的PAM序列，而saCas9识别5'-NNGRRT-3'。PAM序列的更多变意味着可用于基因组编辑的基因座数目增加。当需要使用同源性定向修复的基因的精确编辑时，这是特别有益的，因为当识别序列非常接近待编辑区域时HDR是最有效的。

saCas9更长的PAM的一个缺点是，这个序列在基因组中比spCas9的PAM序列发生基因编辑的可能性小，限制了它的潜在效用。但是，saCas9较长的PAM序列增加了识别的特异性，有助于防止脱靶效应。

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