CRISPR-Cas9基因编辑不只是剪开DNA这么简单

前言

我只是搬运工，这部分内容我参考的内容有：
CRISPR Editing is All About DNA Repair Mechanisms
CRISPR-guide
MMEJ-assisted gene knock-in using TALENs and CRISPR-Cas9 with the PITCh systems
Addgene网站可是好东西，如果想要学习CRISPR-Cas9，Addgene整理的各种学习资料是相当齐全的。

DNA repair

在外界损伤的刺激下, 细胞能启动 7 条修复通路来分别应对不同类型的损伤: （1） 直接修复 (direct repair, DR) 通路; （2）碱基切除修复 (base excision repair, BER); （3） 核苷酸切除修复 (nucleotide excision repair, NER); （4）碱基错配修复 (mismatch repair, MMR) 纠正碱基错配; （5）同源重组修复 (homologous repair, HR); （6）非同源的末端连接 (non-homologous end-joining, NHEJ) 通路；（7）translesion DNA 合成 (translesion DNA synthesis, TLS)； 其中后HR，NHEJ通路专门修复 DNA 双链断裂 (DSBs)。

CRISPR and DNA repair

CRISPR被誉为“基因剪刀，上帝之手”，会让人以为，CRISPR基因编辑就是切开DNA，造成DNA缺失。当然这可能是我自己个人的初步感觉，但认真复盘CRISPR基因编辑我们会发现它的过程大概如下（参考文章：Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system）：
Cas蛋白在sgRNA的带领下，切开目标PAM后的碱基，之后由DNA修复来达成DNA错配，从而造成基因的改变，而DNA修复有homology-directed repair (HDR，有模板，可用单链ssODNs和双链DNA)和nonhomologous end joining (NHEJ)，从而达到基因编辑的效果。因此，CRISPR是开头，而DNA repair则是最后的关键。

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1. CRISPR Induces DNA Repair Pathways: NHEJ, HDR, and Beyond

CRISPR的工作原理是锁定基因组中的一个精确位置，然后切断两条DNA链，在那个特定的位置产生双链断裂(DSB)。由于细胞无法在DNA被切断的情况下存活很长时间，所以一旦DNA断裂，它们的警报就会响起。修复断裂的步骤很快就开始了。
DNA断裂在许多生物体中是一种自然现象。例如，NA double-stranded break (DSB)发生在减数分裂期间，以促进姐妹染色单体之间的重组。由内源性和外源性因素引起的非预期的DNA断裂对细胞具有潜在的致命性。未修复的断裂也可能导致染色体易位。这些事件与神经、免疫和发育缺陷以及其他类型的功能障碍相关。因此，细胞修复DSB是必要的。

Over millions of years, cells have evolved sophisticated mechanisms to deal with DNA lesions. Below, we will summarize types of DNA repair that are present in eukaryotic cells including:

• Homology-directed repair (HDR)
• Non-homologous end joining (NHEJ)
• Microhomology-mediated end joining (MMEJ)

Homology-directed repair and non-homologous end joining are the two main types of DNA repair. Microhomology-mediated end joining is a less common pathway that is sometimes deployed to repair DNA.

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这里告诉我们，HDR和NHEJ是主要的DNA修复方式，而MMEJ也不能忽视。

3. Non-homologous end joining, NHEJ

非同源末端连接(NHEJ)或经典的非同源末端连接(C-NHEJ)是大多数真核生物修复DSB的主要细胞修复途径。它发生在细胞周期的所有阶段，通常被认为是一种快速修复机制(大约10分钟)。从最基本的意义上说，这种机制的工作原理是通过微小的处理将DNA的钝端重新连接在一起。
该途径涉及几个关键蛋白，包括Ku、DNA- pkcs和DNA连接酶4。

（NHEJ的一个标志是在剪切站点上偶尔的插入或删除(称为indels)。这些indels是可变的，通常为1-10 bp长度。由一个核苷酸或两个核苷酸的倍数组成的吲哚会引起基因序列的移码突变，因此很有可能破坏相关蛋白。尽管任何给定的indel都有大约三分之二的几率导致变型，但NHEJ的大多数修复结果都是可靠的(即，没有形成indels)。然而，由于CRISPR-Cas9可以重新切割修复序列，许多目标序列将在一两天内积累indels。因此，科学家可以依靠NHEJ来实现许多细胞类型的高频率敲除。

NHEJ

目前，研究人员正在探索如何利用NHEJ机制使crispr介导的编辑更有效。例如，使用2-3个单导rna (sgRNAs)来同时切割一个基因。sgRNAs在目标序列中产生多个DSB，导致大量片段被删除。随后的DNA修复直接将断裂的末端连接在一起(减去缺失)。

3. Homology-directed repair, HDR

同源定向修复(HDR)是真核生物中第二常见的dsb修复机制(除了以HDR为主的芽殖酵母)。与NHEJ不同，HDR依靠同源的修复模板(通常是姐妹染色单体)来修复断裂的DNA。因此，当姐妹染色单体在细胞中存在时，HDR在晚期S期和G2期是活跃的。
可以利用HDR机制进行crispr介导的编辑，方法是引入一个外源性DNA模板，该模板包含目的基因的同源序列。这个供体序列被大量引入，因此它比细胞内的姐妹染色单体使用得更频繁。因为使用了模板，所以可以通过HDR进行精确的基因编辑，包括基因敲入和碱基替换。

HDR_addgene图

基本的HDR机制包括几个步骤：
（1）DSB每侧的DNA在5 - 3个方向上被切除(DNA被解开，5个部分被切除)，导致每个断端上有3个悬垂。（2）然后通过一种叫做RPA的蛋白稳定单链外挂，并与Rad51重组酶蛋白(每个形成核蛋白丝)结合。（3）接下来，核蛋白丝侵入同源的修复模板，形成一个位移环(D-Loop)，在其中的悬垂与模板的一个链结合(并取代另一个)。然后3端被DNA聚合酶延伸。
随着修复的继续，后续步骤分为三个子路径:双链断裂修复(DSBR)和合成依赖链退火(SDSA)，以及断裂诱导复制(BIR)。每条通路都根据供体模板产生一个修复的DNA序列。

HDR_addgene图

使用HDR进行基因编辑是出了名的低效。除了被限制在细胞周期的一部分，HDR的发生要慢得多，并与NHEJ竞争。科学家们正在积极研究提高HDR效率的方法。一些已经被探索的因素包括同步细胞到S期和G1期以及化学抑制或基因抑制NHEJ成分。成功地提高HDR的效率，最终将使精确的基因组编辑成为可能。

4. Non-homologous end joining, MMEJ

微同源介导的末端连接(MMEJ)，也称为选择性非同源末端连接(Alt-NHEJ)，是发生在细胞中的一种较少见的机制。通常，该通路活跃于细胞周期的S期和G2期，部分在G0/G1期出现。与经典的NHEJ不同，MMEJ依赖于同源区域来修复断裂。MMEJ的基本过程包括切除切除部位的两侧，从而暴露出微同源的短单链区域。这些区域随后退火，并切断悬垂的3个褶叶。接下来，填补单链缺口，并连接DNA末端。MMEJ是一个独立的机制，和C-NHEJ不同，它不需要使用Ku蛋白或DNA连接酶4。
容易出错的是，MMEJ总是导致DSB两边长度不同的删除。这种缺失常常导致染色体水平的分裂，包括易位和重排。
MMEJ在其他修复途径中的作用尚不完全清楚，目前正在研究中。当MMEJ首次被描述时，它被认为是C-NHEJ缺陷细胞的一种修复备份模式。然而，最近的研究表明，MMEJ也存在于能够激活其他修复途径的细胞中。未来的研究必将进一步阐明这一机制及其在基因组编辑方面的潜力。

结语

CRISPR的效用不仅在于它创造dsb的能力，还在于它依赖细胞自身的机制来修复DNA。
NHEJ和HDR修复途径经常被研究人员用来编辑基因组，方法是敲除基因或敲入感兴趣的序列。
到目前为止，它们已经使大量的研究成为可能，这在十年前是不可能的。除了这里提到的不太常见的机制(如MMEJ)之外，还有其他一些机制正在研究和描述中。随着更多关于DNA如何修复的信息被发现，基因组工程的工具箱可能会进一步扩大。