Seurat | 强烈建议收藏的单细胞分析标准流程（经典归一化与降维方法）（二）
1写在前面
为了做进一步的分析，我们需要对数据进行归一化（Normalization）和标准化（Z-score）。
这里我们介绍一下经典的Normalization方法，这个方法假设所有细胞均含有10,000个UMI。
2用到的包
rm(list = ls())
library(Seurat)
library(tidyverse)
library(SingleR)
library(celldex)
library(RColorBrewer)
library(SingleCellExperiment)
3示例数据
这里我们还是使用之前建好的srat文件，我之前保存成了.Rdata，这里就直接加载了。✌️
load("./srat.Rdata")
srat
4归一化
Note! 这里做的是log-normalization， 大家不要重复取log。
srat <- NormalizeData(srat)
5高变基因
5.1 计算高变基因
找一下高变基因吧，这里补充一下可用的方法：
-
vst -
mvp -
disp
srat <- FindVariableFeatures(srat, selection.method = "vst", nfeatures = 2000)
5.2 Top 10
我们取一下高变基因的top10，在后面的可视化中标注出来。
top10 <- head(VariableFeatures(srat), 10)
top10
5.3 可视化
plot1 <- VariableFeaturePlot(srat)
LabelPoints(plot = plot1,
points = top10,
repel = TRUE,
xnudge = 0,
ynudge = 0)
6标准化
细心的小伙伴肯定发现了gene的表达差异较大，这样做出来的图就会不好看。
我们在这里接着做一个Z-score, 将Normalization后的数据转为均值为0，标准差为1的数据。
all.genes <- rownames(srat)
srat <- ScaleData(srat, features = all.genes)
7主成分分析
大家可以通过features参数设置纳入PCA的基因数。
这里我们取前2000个高变基因进行分析。
srat <- RunPCA(srat,
features = VariableFeatures(object = srat))
## 可视化
VizDimLoadings(srat, dims = 1:9,
reduction = "pca") +
theme(axis.text=element_text(size=5),
axis.title=element_text(size=8,face="bold"))
当然你也可以用热图的形式来展示结果。
DimHeatmap(srat, dims = 1:6, nfeatures = 20, cells = 500, balanced = T)
8选取多少PC才合适？
我们先看一下UMAP图。
DimPlot(srat) # umap, then tsne, then pca
通过ElbowPlot我们可以发现，在10的地方有明显的下降。
ElbowPlot(srat)
9聚类
9.1 开始聚类
之前确定了10个PCs最合适，这里我们将PC1:10纳入，进行聚类。
这一步非常重要，因为后面marker的选择要基于聚类的结果。
srat <- FindNeighbors(srat, dims = 1:10)
srat <- FindClusters(srat, resolution = 0.8)
UMAP降维。
srat <- RunUMAP(srat, dims = 1:10, verbose = T)
这个时候我们就有一个新的clusters信息了，看一下吧。
table([email protected]$seurat_clusters)
9.2 聚类结果可视化
1️⃣ 质控前~
DimPlot(srat,label.size = 4,repel = T,label = T)
2️⃣ 质控后~
srat <- subset(srat, subset = QC == 'Pass')
DimPlot(srat,label.size = 4,repel = T,label = T)
9.3 聚类效果简单评价
这里给大家提供一个简单的评价方法，假设我们已知:
树突状细胞(DCs)的marker是：LILRA4和TPM2;血小板(platelets)的marker是：PPBP和GP1BB。
我们看下这些marker是否都显著表达在一类细胞群中。
FeaturePlot(srat, features = c("LILRA4", "TPM2", "PPBP", "GP1BB"))
需要示例数据的小伙伴，在公众号回复
Seurat获取吧！点个在看吧各位~ ✐.ɴɪᴄᴇ ᴅᴀʏ 〰
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