操作记录-2020-10-30：daizhongye_RNA_seq

隔了一个月又来操作一次，老菜鸟的脑子明显不够用啊。

dir=/f/xudonglab/zexing/projects/daizhongye/RNA_seq/2020_10_29
mkdir -p ${dir}/aligned ${dir}/aligned/ballgown ${dir}/aligned/bam ${dir}/aligned/bam.index ${dir}/aligned/bam.sort ${dir}/aligned/sam ${dir}/fastqc_report ${dir}/GSEA ${dir}/MD5_txt ${dir}/raw ${dir}/scripts_log

1. 检查上传数据的完整性

操作记录如下：

#显示各数据的完整性代码
(base) zexing@DNA:~/projects/daizhongye/RNA_seq/2020_10_29/MD5_txt$ cat md5.txt
efcc57e9ff0bd5c3f4a04dcd01513903  raw/E14_Scr_SL_1.fq.gz
657fe81df85e0f3c246c3bcfbc07a4c3  raw/E14_Scr_SL_2.fq.gz
56808aabfa366957e63df968e586d7bc  raw/E14_shT1_1_1.fq.gz
6497464b97496d6da76d22177bddd672  raw/E14_shT1_1_2.fq.gz
e292972349e7331dc28200421b6a927c  raw/E14_shT1_2_1.fq.gz
366826927ab1ea176d82352daf08f6ba  raw/E14_shT1_2_2.fq.gz
0f132bcf9b81fecb450db1ba33b2f577  raw/E14_shT2_1_1.fq.gz
b16d41d1eabcb03feafce2fd197090b8  raw/E14_shT2_1_2.fq.gz
f201561de55191ebfcf8987f1ae45571  raw/E14_shT2_2_1.fq.gz
99693aa2350c21c1f57b9845740c604e  raw/E14_shT2_2_2.fq.gz
#将各数据的完整代码统一写入待检查的文件中
(base) zexing@DNA:~/projects/daizhongye/RNA_seq/2020_10_29/MD5_txt$ echo "efcc57e9ff0bd5c3f4a04dcd01513903  raw/E14_Scr_SL_1.fq.gz
657fe81df85e0f3c246c3bcfbc07a4c3  raw/E14_Scr_SL_2.fq.gz
56808aabfa366957e63df968e586d7bc  raw/E14_shT1_1_1.fq.gz
6497464b97496d6da76d22177bddd672  raw/E14_shT1_1_2.fq.gz
e292972349e7331dc28200421b6a927c  raw/E14_shT1_2_1.fq.gz
366826927ab1ea176d82352daf08f6ba  raw/E14_shT1_2_2.fq.gz
0f132bcf9b81fecb450db1ba33b2f577  raw/E14_shT2_1_1.fq.gz
b16d41d1eabcb03feafce2fd197090b8  raw/E14_shT2_1_2.fq.gz
f201561de55191ebfcf8987f1ae45571  raw/E14_shT2_2_1.fq.gz
99693aa2350c21c1f57b9845740c604e  raw/E14_shT2_2_2.fq.gz" >check_md5sum.txt
#执行md5sum 命令对其完整性进行检测
(base) zexing@DNA:~/projects/daizhongye/RNA_seq/2020_10_29$ md5sum -c check_md5sum.txt
raw/E14_Scr_SL_1.fq.gz: OK
raw/E14_Scr_SL_2.fq.gz: OK
raw/E14_shT1_1_1.fq.gz: OK
raw/E14_shT1_1_2.fq.gz: OK
raw/E14_shT1_2_1.fq.gz: OK
raw/E14_shT1_2_2.fq.gz: OK
raw/E14_shT2_1_1.fq.gz: OK
raw/E14_shT2_1_2.fq.gz: OK
raw/E14_shT2_2_1.fq.gz: OK
raw/E14_shT2_2_2.fq.gz: OK

2. 使用FastQC软件对数据进行质控

vim新建fastqc_script脚本如下：

#上面一行宣告这个script的语法使用bash语法，当程序被执行时，能够载入bash的相关环境配置文件。
# Program:
#       This program is used for analysis of RNA-seq data by FastQC.
#History:
# 2020/10/29         zexing              First release
#fastqc命令为质控命令
#Usage: fastqc [-o output dir] [--(no)extract] [-f fastq|bam|sam] [-c contaminant file] seqfile1 .. seqfileN
#简写代码：fastqc -t 16 -o  seqfile1
#调用程序fastqc，参数-t设置线程数为8，参数-o设置结果输出的目录，参数-c可以加入污染物选项（接头信息），最后为读入文件。
dir=/f/xudonglab/zexing/projects/daizhongye/RNA_seq/2020_10_29
fastqc -t 16 -o ${dir}/fastqc_report/ ${dir}/raw/*.fq.gz

后台运行fastqc_scrip如下脚本：

(base) zexing@DNA:~/projects/daizhongye/RNA_seq/2020_10_29/scripts_log$ nohup bash fastqc_script > fastqc_script_log &
[1] 176237

3. 使用Hisat2软件对测序结果进行比对

vim新建hisat2_script脚本如下：

#! /bin/bash
#上面一行宣告这个script的语法使用bash语法，当程序被执行时，能够载入bash的相关环境配置文件。
# Program:
#       This program is used for aligning of RNA-seq data.
#History:
# 2020/10/30         zexing              First release
#对变量${i}利用 for ${i} in A B C D 的方式遍历指定
#hisat2命令为序列比对命令
#Usage: hisat2 [options]* -x  {-1  -2  | -U  | --sra-acc } [-S ]
#简写代码：hisat2 -t -p 8 -x  -1 fq.gz -2 fq.gz -S 
#调用程序hisat2，参数-t显示时间，参数-p设定线程数，参数-x指定参考基因组索引文件的前缀（目录及文件前缀）
#参数-1指定双向测序的第一条.fq.gz测序数据，如果多组数据，使用逗号将文件分隔
#参数-2指定双向测序的第二条.fq.gz测序数据，如果多组数据，使用逗号将文件分隔
#参数-S指定比对结果的输出目录及名称
dir=/f/xudonglab/zexing/projects/daizhongye/RNA_seq/2020_10_29
for i in E14_Scr_SL E14_shT1_1 E14_shT1_2 E14_shT2_1 E14_shT2_2
do
hisat2 -t -p 16 -x /f/xudonglab/zexing/reference/UCSC_mm10/hisat2_index/hisat2_index_mm10 \
-1 ${dir}/raw/${i}_1.fq.gz \
-2 ${dir}/raw/${i}_2.fq.gz \
-S ${dir}/aligned/sam/${i}.sam
done

后台运行hisat2_script脚本如下：

(base) zexing@DNA:~/projects/daizhongye/RNA_seq/2020_10_29/scripts_log$ nohup bash hisat2_script > hisat2_script_log &
[1] 180160

4. 使用SAMtools软件对文件进行格式转换、排序

vim新建samtools_script如下：

#!/bin/bash
#上面一行宣告这个script的语法使用bash语法，当程序被执行时，能够载入bash的相关环境配置文件。
# Program:
#这里写一个脚本，将samtools的view、sort、index和flagstat四个命令串联在一起，对RNA-seq数据批量处理。
#History:
# 2020/10/30         李泽兴      First release
#对变量${i}利用 for ${i} in A B C D 的方式遍历指定
#samtools view为格式转换命令
#Usage: samtools view [options]  |  |  [region...]
#-@设置线程数为8， -S输入sam文件，-1b使用快速压缩比生成bam文件，-o设定标准输出文件名。
#简写代码：samtools view -@ 8 -S {$i}.sam -1b -o {$i}.bam
#samtools sort为排序命令
#Usage: samtools sort [options..] [in.bam]
#-@设置线程数为8，-l设置压缩比为5，-o设定标准输出文件名，最后一个为输入.bam文件，该命令默认为染色体位置排序，不影响后期操作。
#简写代码：samtools sort -@ 8 -l 5 -o {$i}.bam.sort {$i}.bam
#index为建立索引命令，目前还不知道这样建立索引有何用处，暂且写下来以备后续使用。
#Usage: samtools index [-bc] [-m INT]  
#-@设置线程数为8，输入bam文件，输出index文件。
#简写代码：samtools index -@ 8 {$i}.bam.sort {$i}.bam.index
#flagstat为查看比对情况命令，目前暂且对这部分不是很熟悉，暂且写下来以备后续使用。
#Usage: samtools flagstat [options] 
#-@设置线程数为8，对于输出内容重定向写入>指定文件
#简写代码：samtools flagstat -@ 8 {$i}.bam.sort > {$i}.bam.flagstat
dir=/f/xudonglab/zexing/projects/daizhongye/RNA_seq/2020_10_29/aligned
for i in E14_Scr_SL E14_shT1_1 E14_shT1_2 E14_shT2_1 E14_shT2_2
do
samtools view -@ 16 -S ${dir}/sam/${i}.sam -1b -o ${dir}/bam/${i}.bam
samtools sort -@ 16 -l 5 -o ${dir}/bam.sort/${i}.bam.sort ${dir}/bam/${i}.bam
samtools index -@ 16 ${dir}/bam.sort/${i}.bam.sort ${dir}/bam.index/${i}.bam.index
samtools flagstat -@ 16 ${dir}/bam.sort/${i}.bam.sort > ${dir}/${i}.bam.flagstat
done

后台运行samtools_script脚本如下：

#后台运行命令如下：
 zexing@DNA:~/projects/daizhongye/RNA_seq/2020_10_29/scripts_log$ nohup bash samtools_script > samtools_script_log &
[3] 6353

5. 使用Stringtie软件进行拼接和定量

vim新建stringtie_script如下：

#!/bin/bash
#上面一行宣告这个script的语法使用bash语法，当程序被执行时，能够载入bash的相关环境配置文件。
#program
#     This program is to perform HTSeq-count assay for RNA-seq data.
#History
#     2020/10/30       zexing            First release
#对变量${i}利用 for ${i} in A B C D 的方式遍历指定
#创建针对不同样品的ballgown/"$i"目录，以存放输出结果
#stringtie为转录本拼接和定量的软件
#利用stringtie分别输出gene count数目和FPKM值，gene count数用户基因差异分析，FPKM值为基因表达值，用于heatmap等绘制
#Usage: stringtie  [options]
#aligned_reads.bam 是输入文件，该输入文件要求必须按基因组位置排序
#参数-o []，设置StringTie组装转录本的输出GTF文件的路径和文件名。
#参数-p 指定组装转录本的线程数（CPU）
#参数-G 使用参考注释基因文件指导组装过程，格式GTF/GFF3。输出文件中既包含已知表达的转录本，也包含新的转录本。
#参数-B 应用该选项，则会输出Ballgown输入表文件（* .ctab），其中包含用-G选项给出的参考转录本的覆盖率数据。
#参数-e 限制reads比对的处理，仅估计和输出与用-G选项给出的参考转录本匹配的组装转录本。使用该选项，则会跳过处理与参考转录本不匹配的组装转录本，这将大大的提升了处理速度。
#参数-A  输出基因丰度的文件（制表符分隔格式）
#简写代码：stringtie {$i}.bam.sort -o path/name.gtf -p 16 -G gene.gtf -eB -A path/name.tab
#此次主要输出两个文件：gtf文件用于转换gene count文件；tab文件包含FPKM数值。
dir=/f/xudonglab/zexing/projects/daizhongye/RNA_seq/2020_10_29/aligned
for i in E14_Scr_SL E14_shT1_1 E14_shT1_2 E14_shT2_1 E14_shT2_2
do
mkdir ${dir}/ballgown/"$i"
stringtie ${dir}/bam.sort/"$i".bam.sort -o ${dir}/ballgown/"$i"/"$i".gtf \
-p 16 -G /f/xudonglab/zexing/reference/UCSC_mm10/mm10_genes.gtf -e -B \
-A ${dir}/ballgown/"$i"/"$i".gene.tab
done

后台运行stringtie_script脚本如下

(base) zexing@DNA:~/projects/daizhongye/RNA_seq/2020_10_29/scripts_log$ nohup bash stringtie_script > stringtie_script_log &
[1] 36868

6. 使用prepDE.py脚本提取read counts数值

注意：prepDE.py为python2的脚本，应该先将python设置为低版本后再运行脚本。
操作记录如下：

#从之前的文件夹中将prepDE.py脚本拷贝至当前文件夹中的ballgown子文件夹中
(base) zexing@DNA:~/projects/daizhongye/RNA_seq/2020_10_29/aligned/ballgown$  cp /f/xudonglab/zexing/projects/zhaoxiujuan/aligned/ballgown_1/prepDE.py ./

#退出当前conda环境
(base) zexing@DNA:~/projects/daizhongye/RNA_seq/2020_10_29/aligned/ballgown$ conda deactivate

#检查服务器中的python版本信息
zexing@DNA:~/projects/daizhongye/RNA_seq/2020_10_29/aligned/ballgown$ python --version
Python 2.7.12

#使用python命令直接运行脚本
zexing@DNA:~/projects/daizhongye/RNA_seq/2020_10_29/aligned/ballgown$ python prepDE.py

#查看运行结果
zexing@DNA:~/projects/daizhongye/RNA_seq/2020_10_29/aligned/ballgown$ ll
total 1.8M
drwxrwxr-x 7 zexing zexing 4.0K 10月 30 13:02 .
drwxrwxr-x 8 zexing zexing 4.0K 10月 29 16:26 ..
drwxrwxr-x 3 zexing zexing 4.0K 10月 30 12:46 E14_Scr_SL
drwxrwxr-x 2 zexing zexing 4.0K 10月 30 12:48 E14_shT1_1
drwxrwxr-x 2 zexing zexing 4.0K 10月 30 12:51 E14_shT1_2
drwxrwxr-x 2 zexing zexing 4.0K 10月 30 12:55 E14_shT2_1
drwxrwxr-x 2 zexing zexing 4.0K 10月 30 12:59 E14_shT2_2
-rw-rw-r-- 1 zexing zexing 794K 10月 30 13:02 gene_count_matrix.csv
-rw-rw-r-- 1 zexing zexing  12K 10月 30 12:47 prepDE.py
-rw-rw-r-- 1 zexing zexing 987K 10月 30 13:02 transcript_count_matrix.csv

#其中"gene_count_matrix.csv"即是DESeq2的输入文件。

以下分析在本地机的Rstudio中完成

7. 利用DESeq2包进行差异基因分析

代码如下：

#This script is used for analysis of daizhongye RNA-seq data
#History
# Lizexing           2020-10-30             First release
#genecount文件来源于Stringtie软件分析，后面为本地电脑操作
# DESeq2进行差异分析 ----------------------------------------------------------------

#清空环境变量
rm(list=ls())
#设置工作目录
setwd("G:/daizhongye/RNA-seq/2020_10_29/gene_count/")
#读入基因表达值，设定行名为gene_id
gene_count <- read.csv("gene_count_matrix.csv",stringsAsFactors = F)
#对gene_id一列进行拆分，去除重复名称
library(stringr)
#设置空的"gene_count_1"向量，行数与上面的测序结果一致
gene_count_1<-rep(NA,nrow(gene_count))
#利用for循环，对gene_count数据框中的重复列进行拆分提取
for (i in 1:nrow(gene_count)){
  gene_count_1[i] <- unlist(str_split(gene_count[i,1], pattern = "\\|"))[1]
}
#显示拆分后的结果
head(gene_count_1)
#对原数据框中的特定序列重新赋值
gene_count$gene_id <- gene_count_1
#显示文件的前6行信息
head(gene_count)
#将第一列作为文件的行名
rownames(gene_count) <- gene_count[,1]
gene_count <-gene_count[,-1]
#显示文件的前6行信息
head(gene_count)
#将各组数据分开
gene_count_group_1 <- gene_count[, 1:3]
gene_count_group_2 <- gene_count[, c(1, 4, 5)]
#将该文件保存至对应目录
write.csv(gene_count_group_1, file = "G:/daizhongye/RNA-seq/2020_10_29/gene_count/gene_count_group_1.csv", row.names = TRUE)
write.csv(gene_count_group_2, file = "G:/daizhongye/RNA-seq/2020_10_29/gene_count/gene_count_group_2.csv", row.names = TRUE)

#加载DESeq2包
library(DESeq2)
#DESeq2需要三种矩阵，分别为countData表达矩阵,colData样品信息矩阵及design差异表达矩阵
#countData为表达矩阵即gene_count
#colData为样品信息矩阵即coldata
#design为差异表达矩阵即批次和条件（对照、处理）等
#设置condition样品组别、重复数
condition_group_1 <- factor(c(rep("scr", 1), rep("shT1", 2)), levels = c("scr","shT1"))
condition_group_2 <- factor(c(rep("scr", 1), rep("shT2", 2)), levels = c("scr","shT2"))
#显示condition设置信息
condition_group_1
condition_group_2
#设置group组对应的样品信息矩阵colData
colData_group_1 <- data.frame(row.names = colnames(gene_count_group_1), condition_group_1)
colData_group_2 <- data.frame(row.names = colnames(gene_count_group_2), condition_group_2)
#显示colData设置信息
colData_group_1
colData_group_2
#在R里面用于构建公式对象，~左边为因变量，右边为自变量。
#标准流程：dds <- DESeqDataSetFromMatrix(countData = cts, colData = coldata, design= ~ batch + condition) 
#countData为表达矩阵即countdata
#colData为样品信息矩阵即coldata
#design为差异表达矩阵即批次和条件（对照、处理）等
#对dds_group进行标准流程构建
dds_group_1 <- DESeqDataSetFromMatrix(gene_count_group_1, colData_group_1, design = ~condition_group_1)
dds_group_2 <- DESeqDataSetFromMatrix(gene_count_group_2, colData_group_2, design = ~condition_group_2)
#对原始dds_group进行normalize
dds_group_1 <- DESeq(dds_group_1)
dds_group_2 <- DESeq(dds_group_2)
#显示dds信息
dds_group_1
dds_group_2

# 对差异分析结果进行保存 -------------------------------------------------------------

#使用DESeq2包中的results()函数，提取差异分析的结果
#Usage:results(object, contrast, name, .....）
#将提取的差异分析结果定义为变量"res" 
#contrast: 定义谁和谁比较，处理组在前，对照组在后
#将group组提取分析结果并保存为res
res_group_1 = results(dds_group_1, contrast=c("condition_group_1","shT1","scr"))
res_group_2 = results(dds_group_2, contrast=c("condition_group_2","shT2","scr"))

#对结果res利用order()函数按pvalue值进行排序
#创建矩阵时，X[i,]指矩阵X中的第i行，X[,j]指矩阵X中的第j列
#order()函数先对数值排序，然后返回排序后各数值的索引，常用用法：V[order(V)]或者df[order(df$variable),]
#对res_group组进行排序
res_group_1 = res_group_1[order(res_group_1$pvalue),]
res_group_2 = res_group_2[order(res_group_2$pvalue),]

#显示res结果前6行信息
head(res_group_1)
head(res_group_2)

#对res_group矩阵进行总结，利用summary命令统计显示一共多少个genes上调和下调
summary(res_group_1)
summary(res_group_2)

#将差异分析的所有结果进行输出保存
write.csv(res_group_1, file="G:/daizhongye/RNA-seq/2020_10_29/Rtreatment/all_different_genes/all_different_genes_group_1_genecount.csv")
write.csv(res_group_2, file="G:/daizhongye/RNA-seq/2020_10_29/Rtreatment/all_different_genes/all_different_genes_group_2_genecount.csv")

#利用table函数统计显著差异基因的数目
#显著差异的定义为pvalue<0.05
table(res_group_1$pvalue<0.05)
table(res_group_2$pvalue<0.05)

#对具有显著性差异的结果进行过滤、提取
#获取pvalue小于0.05，表达倍数取以2为对数后大于0.584963或者小于-0.584963的差异表达基因（即表达倍数相差1.5倍及以上）
#使用subset()函数过滤需要的结果至新的变量significant_different_genes_group中
#Usage:subset(x, ...)，其中x为objects，...为筛选参数或条件
#对group中数据进行过滤、提取
significant_pvalue_different_genes_group_1 <- subset(res_group_1, pvalue < 0.05 & abs(log2FoldChange) > 0.584963)
significant_pvalue_different_genes_group_2 <- subset(res_group_2, pvalue < 0.05 & abs(log2FoldChange) > 0.584963)

#使用dim函数查看该结果的维度、规模
dim(significant_pvalue_different_genes_group_1)
dim(significant_pvalue_different_genes_group_2)
#显示结果的前6行信息
head(significant_pvalue_different0_genes_group_1)
head(significant_pvalue_different_genes_group_2)

#对显著差异基因进行输出保存
write.csv(significant_pvalue_different_genes_group_1, file = "G:/daizhongye/RNA-seq/2020_10_29/Rtreatment/significant_different_genes/significant_pvalue_different_genes_group_1_genecount.csv")
write.csv(significant_pvalue_different_genes_group_2, file = "G:/daizhongye/RNA-seq/2020_10_29/Rtreatment/significant_different_genes/significant_pvalue_different_genes_group_2_genecount.csv")

8. 利用ggpubr包绘制火山图

代码如下：

# 火山图 ---------------------------------------------------------------------

#代码参考网站：https://www.jianshu.com/p/e651a182c65d
#火山图的图形非常像火山喷发的形状。
#火山图通常用来展示差异表达的基因，常常出现在芯片、转录组、蛋白组、代谢组等组学检测技术的结果中，并且通常伴随热图一起出现。

#清空环境变量
rm(list=ls())
#获取当前工作目录
getwd()
#设置工作目录
setwd("G:/daizhongye/RNA-seq/2020_10_29/Rtreatment/all_different_genes")
#读取数据至deg.data变量中
#此处需要读取DESeq2分析的全部差异基因，包括显著和非显著基因
#对group_1的全部差异基因进行读取
deg.data_group_1 <- read.csv("G:/daizhongye/RNA-seq/2020_10_29/Rtreatment/all_different_genes/all_different_genes_group_1_genecount.csv", header = T, sep = ",")
#对group_2的全部差异基因进行读取
deg.data_group_2 <- read.csv("G:/daizhongye/RNA-seq/2020_10_29/Rtreatment/all_different_genes/all_different_genes_group_2_genecount.csv", header = T, sep = ",")

#更改文件行名称为第一列
rownames(deg.data_group_1) <- deg.data_group_1$X
rownames(deg.data_group_2) <- deg.data_group_2$X

#更改文件列名称为需要的名称
colnames(deg.data_group_1)  <- c("gene_symbol",colnames(deg.data_group_1)[c(2:7)])
colnames(deg.data_group_2)  <- c("gene_symbol",colnames(deg.data_group_2)[c(2:7)])

#显示文件前6行查看文件信息
head(deg.data_group_1)
head(deg.data_group_2)

###画火山图只需要其中的log2FC和padj就可以，daizhongye选用pvalue值进行筛选，故此后使用pvalue进行设置
#adj.p.value为校正后的P值，因为基因和基因并不是相互独立的，所以我们需要对P值进行校正来降低结果的假阳性，常用的校正方法为FDR校正
#绘图之前需要对pvalue进行转换，可以拉开差异表达基因之间的间距
#对差异基因pvalue值进行log10转换
deg.data_group_1$logP <- -log10(deg.data_group_1$pvalue)
deg.data_group_2$logP <- -log10(deg.data_group_2$pvalue)

#开始绘制基本热图
#利用ggplot2的两个包绘制火山图
#安装ggpubr包、ggthemes包
#install.packages("ggpubr")
#install.packages("ggthemes")
#设置工作目录
setwd("G:/daizhongye/RNA-seq/2020_10_29/Rtreatment/火山图")

#加载ggpubr包
library(ggpubr)
library(ggthemes)
#x轴为实验组基因表达量比对照组基因表达量的倍数差异
#y轴则为实验组比对照组之后的pvalue值
#火山图上一个点代表一个基因，而颜色则代表他们是显著上调还是显著下调
ggscatter(deg.data_group_1, x="log2FoldChange", y="logP") + theme_base()
ggscatter(deg.data_group_2, x="log2FoldChange", y="logP") + theme_base()

#上述命令出来的图很丑，需要对log2FoldChange和pvalue数据进行过滤
#新加一列Group
deg.data_group_1$Group = "not-significant"
deg.data_group_2$Group = "not-significant"

#将pvalue<0.05且log2FC>=0.584963的基因设为显著上调基因
deg.data_group_1$Group[which((deg.data_group_1$pvalue<0.05) & (deg.data_group_1$log2FoldChange >=0.584963))] ="up-regulated"
deg.data_group_2$Group[which((deg.data_group_2$pvalue<0.05) & (deg.data_group_2$log2FoldChange >=0.584963))] ="up-regulated"

#将pvalue<0.05且log2FC=<-1的基因设为显著下调基因
deg.data_group_1$Group[which((deg.data_group_1$pvalue<0.05) & (deg.data_group_1$log2FoldChange <= -0.584963))] ="down-regulated"
deg.data_group_2$Group[which((deg.data_group_2$pvalue<0.05) & (deg.data_group_2$log2FoldChange <= -0.584963))] ="down-regulated"

#查看上调和下调基因数目
table(deg.data_group_1$Group)
table(deg.data_group_2$Group)

#使用添加了上调和下调基因的数据重新绘制火山图
#使用color参数指定点的颜色
ggscatter(deg.data_group_1, x = "log2FoldChange", y = "logP", 
          color = "Group") + theme_base()

ggscatter(deg.data_group_2, x = "log2FoldChange", y = "logP", 
          color = "Group") + theme_base()

#修改点的大小size和更改差异表达基因的颜色palette
ggscatter(deg.data_group_1, x = "log2FoldChange", y = "logP", 
          color = "Group",
          palette = c("green", "gray", "red"),
          size = 1) + theme_base()

ggscatter(deg.data_group_2, x = "log2FoldChange", y = "logP", 
          color = "Group",
          palette = c("green", "gray", "red"),
          size = 1) + theme_base()

#使用geom_hline和geom_vline分别添加横向和纵向的辅助线
#为火山图添加logP分界线（geom_hline）和logFC分界线（geom_vline）
ggscatter(deg.data_group_1, x = "log2FoldChange", y = "logP", 
          color = "Group",
          palette = c("green", "gray", "red"),
          size = 1) + theme_base() +
  geom_hline(yintercept = 1.30, linetype="dashed") +
  geom_vline(xintercept = c(-0.584963,0.584963), linetype="dashed")

ggscatter(deg.data_group_2, x = "log2FoldChange", y = "logP", 
          color = "Group",
          palette = c("green", "gray", "red"),
          size = 1) + theme_base() +
  geom_hline(yintercept = 1.30, linetype="dashed") +
  geom_vline(xintercept = c(-0.584963,0.584963), linetype="dashed")

#为数据增加新的一列Label，将上调和下调差异表达前十的基因绘制在火山图中
#新加一列Label
deg.data_group_1$Label = ""
deg.data_group_2$Label = ""

#对差异表达基因的pvalue值进行从小到大排序
deg.data_group_1 <- deg.data_group_1[order(deg.data_group_1$pvalue),]
deg.data_group_2 <- deg.data_group_2[order(deg.data_group_2$pvalue),]

#高表达的基因中，选择pvalue最小的10个
up.genes_group_1 <- head(deg.data_group_1$gene_symbol[which(deg.data_group_1$Group == "up-regulated")], 10)
up.genes_group_2 <- head(deg.data_group_2$gene_symbol[which(deg.data_group_2$Group == "up-regulated")], 10)

#低表达的基因中，选择pvalue最小的10个
down.genes_group_1 <- head(deg.data_group_1$gene_symbol[which(deg.data_group_1$Group == "down-regulated")], 10)
down.genes_group_2 <- head(deg.data_group_2$gene_symbol[which(deg.data_group_2$Group == "down-regulated")], 10)

#将up.genes和down.genes合并
deg.top10.genes_group_1 <- c(as.character(up.genes_group_1), as.character(down.genes_group_1))
deg.top10.genes_group_2 <- c(as.character(up.genes_group_2), as.character(down.genes_group_2))

#将top10.gens加入到Label中
deg.data_group_1$Label[match(deg.top10.genes_group_1, deg.data_group_1$gene_symbol)] <- deg.top10.genes_group_1
deg.data_group_2$Label[match(deg.top10.genes_group_2, deg.data_group_2$gene_symbol)] <- deg.top10.genes_group_2

#参数说明：https://www.jianshu.com/p/674f90e020fa
#改变火山图点的颜色和坐标轴标注，使图片更美观
#绘制group1的最终火山图
#对输出的图保存至相应目录
pdf("Group_1_火山图.pdf")
ggscatter(deg.data_group_1, x = "log2FoldChange", y = "logP", 
          color = "Group",
          palette = c("#2f5688", "#BBBBBB", "#CC0000"),
          size = 1,
          label =deg.data_group_1$Label,
          font.label = 8,
          repel =T,
          xlim = c(-15, 15),  # x坐标轴的范围
          xlab = "log2FoldChange",
          ylab = "-log10(P-value)",) + theme_base() +
  geom_hline(yintercept = 1.30, linetype="dashed") +
  geom_vline(xintercept = c(-0.584963,0.584963), linetype="dashed")
dev.off()

#绘制group2的最终火山图
#对输出的图保存至相应目录
pdf("Group_2_火山图.pdf")
ggscatter(deg.data_group_2, x = "log2FoldChange", y = "logP", 
          color = "Group",
          palette = c("#2f5688", "#BBBBBB", "#CC0000"),
          size = 1,
          label =deg.data_group_2$Label,
          font.label = 8,
          repel =T,
          xlim = c(-10, 10),  # x坐标轴的范围
          xlab = "log2FoldChange", 
          ylab = "-log10(P-value)",) + theme_base() +
  geom_hline(yintercept = 1.30, linetype="dashed") +
  geom_vline(xintercept = c(-0.584963,0.584963), linetype="dashed")
dev.off()

9. 利用 pheatmap包绘制heatmap图

代码如下：

# heatmap ----------------------------------------------------------------------
#heatmap绘制时，需要使用gene_symbol和FPKM值
#关于FPKM值的说明
#在绘制heatmap热图时，需要使用差异基因所对应的FPKM值，该值的获取有几个办法：
#利用Stringtie的-A参数直接获得
#利用DESeq2的-FPKM参数由count转化获得
#利用ballgown包进行转化获得
#本次采用StringTie的-A参数直接获得

#关于gene_symbol的说明
#对于绘制heatmap图的gene，使用具有差异性的基因进行绘图
#利用之前DESeq2分析得到的abs(log2FoldChange)>=1的基因来做图
#需要根据"significant_different_genes"来从包含FPKM值的文件中将其提取出来，使用到了match()函数

#绘图前的准备工作

#对FPKM数据进行整理
#清空环境变量
rm(list=ls())
#获取当前工作目录
getwd()
#设置工作目录
setwd("G:/daizhongye/RNA-seq/2020_10_29/gene_tab/")

##将StringTie分析得到的含有FPKM数据的TAB文件导入当前工作环境中
E14_Scr_SL.gene.tab <- read.table("G:/daizhongye/RNA-seq/2020_10_29/gene_tab/E14_Scr_SL.gene.tab", header = TRUE, sep = "\t" , quote = "\"")
E14_shT1_1.gene.tab <- read.table("G:/daizhongye/RNA-seq/2020_10_29/gene_tab/E14_shT1_1.gene.tab", header = TRUE, sep = "\t" , quote = "\"")
E14_shT1_2.gene.tab <- read.table("G:/daizhongye/RNA-seq/2020_10_29/gene_tab/E14_shT1_2.gene.tab", header = TRUE, sep = "\t" , quote = "\"")
E14_shT2_1.gene.tab <- read.table("G:/daizhongye/RNA-seq/2020_10_29/gene_tab/E14_shT2_1.gene.tab", header = TRUE, sep = "\t" , quote = "\"")
E14_shT2_2.gene.tab <- read.table("G:/daizhongye/RNA-seq/2020_10_29/gene_tab/E14_shT2_2.gene.tab", header = TRUE, sep = "\t" , quote = "\"")


##提取指定列的内容
###对数据中的Gene.ID和FPKM两列数据进行提取
E14_Scr_SL.FPKM <- E14_Scr_SL.gene.tab[,c(1,8)]
E14_Scr_SL.FPKM <- E14_shT1_1.gene.tab[,c(1,8)]
E14_shT1_2.FPKM <- E14_shT1_2.gene.tab[,c(1,8)]
E14_shT2_1.FPKM <- E14_shT2_1.gene.tab[,c(1,8)]
E14_shT2_2.FPKM <- E14_shT2_2.gene.tab[,c(1,8)]

###重命名指定列
###重命名全部的列是name(data) <- c("NO","name")
###重命名单个列是colnames(data)[2] <- 'newname'
colnames(E14_Scr_SL.FPKM)[2] <-"Scr_SL"
colnames(E14_shT1_1.FPKM)[2] <-"shT1_1"
colnames(E14_shT1_2.FPKM)[2] <-"shT1_2"
colnames(E14_shT2_1.FPKM)[2] <-"shT2_1"
colnames(E14_shT2_2.FPKM)[2] <-"shT2_2"

###显示新的数据信息
head(E14_Scr_SL.FPKM)
head(E14_shT1_1.FPKM)
head(E14_shT1_2.FPKM)
head(E14_shT2_1.FPKM)
head(E14_shT2_2.FPKM)


##将得到的各样本的FPKM值数据保存入heatmap目录
write.table(E14_Scr_SL.FPKM, file = "G:/daizhongye/RNA-seq/2020_10_29/gene_tab/E14_Scr_SL.FPKM", row.names = FALSE, quote = FALSE, sep = "\t")
write.table(E14_shT1_1.FPKM, file = "G:/daizhongye/RNA-seq/2020_10_29/gene_tab/E14_shT1_1.FPKM", row.names = FALSE, quote = FALSE, sep = "\t")
write.table(E14_shT1_2.FPKM, file = "G:/daizhongye/RNA-seq/2020_10_29/gene_tab/E14_shT1_2.FPKM", row.names = FALSE, quote = FALSE, sep = "\t")
write.table(E14_shT2_1.FPKM, file = "G:/daizhongye/RNA-seq/2020_10_29/gene_tab/E14_shT2_1.FPKM", row.names = FALSE, quote = FALSE, sep = "\t")
write.table(E14_shT2_2.FPKM, file = "G:/daizhongye/RNA-seq/2020_10_29/gene_tab/E14_shT2_2.FPKM", row.names = FALSE, quote = FALSE, sep = "\t")


#对差异基因list进行整理
##设置工作目录
setwd("G:/daizhongye/RNA-seq/2020_10_29/Rtreatment/significant_different_genes")
##将各实验组的差异基因导入当前工作环境
group_1 <- read.csv("significant_pvalue_different_genes_group_1_genecount.csv")
group_2 <- read.csv("significant_pvalue_different_genes_group_2_genecount.csv")

##将各实验组的差异基因list进行提取
group_1_gene <- group_1[,1]
group_2_gene <- group_2[,1]

##查看各差异基因名信息
View(group_1_gene)
View(group_2_gene)

#利用match函数对差异基因List信息（小文件）和FPKM值信息（大文件）进行提取
##利用match函数提取各样品中差异基因所在的行数并重新命名为row.NO文件
##match(x,y)函数输出结果：x向量在y向量中所处的位置，x向量元素不存在y向量中的返回NA
##match(x, table$i)函数输出结果：返回x向量在table中$i列中所处的位置
##对group1各样品进行处理
E14_Scr_SL_group_1_row.NO <- c(match(group_1_gene, E14_Scr_SL.FPKM$Gene.ID))
E14_shT1_1_group_1_row.NO <- c(match(group_1_gene, E14_shT1_1.FPKM$Gene.ID))
E14_shT1_2_group_1_row.NO <- c(match(group_1_gene, E14_shT1_2.FPKM$Gene.ID))


##对group2各样品进行处理
E14_Scr_SL_group_2_row.NO <- c(match(group_2_gene, E14_Scr_SL.FPKM$Gene.ID))
E14_shT2_1_group_2_row.NO <- c(match(group_2_gene, E14_shT2_1.FPKM$Gene.ID))
E14_shT2_2_group_2_row.NO <- c(match(group_2_gene, E14_shT2_2.FPKM$Gene.ID))


#根据以上行数，对各样品的FPKM值进行提取
##对group1各样品的FPKM值进行提取
E14_Scr_SL_group_1_gene_FPKM <- E14_Scr_SL.FPKM[E14_Scr_SL_group_1_row.NO ,]
E14_shT1_1_group_1_gene_FPKM <- E14_shT1_1.FPKM[E14_shT1_1_group_1_row.NO ,]
E14_shT1_2_group_1_gene_FPKM <- E14_shT1_2.FPKM[E14_shT1_2_group_1_row.NO ,]

###查看提取结果，确认各样品行数和基因名一致性
View(E14_Scr_SL_group_1_gene_FPKM)
View(E14_shT1_1_group_1_gene_FPKM)
View(E14_shT1_2_group_1_gene_FPKM)


##对group2各样品的FPKM值进行提取
E14_Scr_SL_group_2_gene_FPKM <- E14_Scr_SL.FPKM[E14_Scr_SL_group_2_row.NO ,]
E14_shT2_1_group_2_gene_FPKM <- E14_shT2_1.FPKM[E14_shT2_1_group_2_row.NO ,]
E14_shT2_2_group_2_gene_FPKM <- E14_shT2_2.FPKM[E14_shT2_2_group_2_row.NO ,]

###查看提取结果，确认各样品行数和基因名一致性
View(E14_Scr_SL_group_2_gene_FPKM)
View(E14_shT2_1_group_2_gene_FPKM)
View(E14_shT2_2_group_2_gene_FPKM)


#利用merge函数对各组实验的FPKM值进行合并
##merge(x,y, by="")
##对group1各样品的FPKM值进行合并
group_1_gene_FPKM <- merge(E14_Scr_SL_group_1_gene_FPKM, merge(E14_shT1_1_group_1_gene_FPKM, E14_shT1_2_group_1_gene_FPKM,by="Gene.ID"), by="Gene.ID")

##对group2各样品的FPKM值进行合并
group_2_gene_FPKM <- merge(E14_Scr_SL_group_2_gene_FPKM, merge(E14_shT2_1_group_2_gene_FPKM, E14_shT2_2_group_2_gene_FPKM, by="Gene.ID"), by="Gene.ID")

##查看合并结果，确认
View(group_1_gene_FPKM)
View(group_2_gene_FPKM)

#将各实验组差异基因对应的FPKM数据保存至heatmap文件中
write.table(group_1_gene_FPKM, file = "G:/daizhongye/RNA-seq/2020_10_29/Rtreatment/heatmap/group_1_gene_FPKM", row.names = FALSE)
write.table(group_2_gene_FPKM, file = "G:/daizhongye/RNA-seq/2020_10_29/Rtreatment/heatmap/group_2_gene_FPKM", row.names = FALSE)

#开始绘制heatmap图啦啦啦啦啦啦啦啦啦
#代码参考网站：https://www.jianshu.com/p/d86e4afe1065

#安装包（作者说这种方式下载的pheatmap包版本更新一些）
#install.packages('devtools')
#library(devtools)
#install_github("raivokolde/pheatmap")

#清空环境变量
rm(list=ls())
#获取当前工作目录
getwd()
#设置工作目录
setwd("G:/daizhongye/RNA-seq/2020_10_29/Rtreatment/heatmap/")

#加载包
library(RColorBrewer)#设置颜色用的
library(pheatmap)
#设置配色方案
cc = colorRampPalette(rev(brewer.pal(n=7, name="RdYlBu"))) #Rd=red Yl=yellow Bu=blue
#读入文件，如果确实过多，会无法聚类，最好保证没有缺失，或将缺失替换为0
Group_1<-read.table(file = "group_1_gene_FPKM",row.names = 1,header = T,check.names = F) 
Group_2<-read.table(file = "group_2_gene_FPKM",row.names = 1,header = T,check.names = F)

#如果矩阵内容是fpkm表达量，一般取log10(fpkm+1)绘图
Group_1=log2(Group_1+1)
Group_2=log2(Group_2+1)

#pheatmap参数解释：
#第一个参数是需要用pheatmap画图的数据
#color: 设置颜色。如果想画得更精细一些，可以取cc(1000)
#main: 标题，会显示在最上面
#fontsize: row的字体大小
#scale: 是否归一化为正态分布，可选row,column,none。一般对row进行归一化的情况比较多，column较少。
#border_color: 是否显示边框及边框的颜色，NA不显示, red显示红色。支持简单的颜色单词
#na_col: 设置缺失值的颜色，支持简单颜色单词，一般设置为灰色就满好识别的。
#cluster_rows & cluster_cols: 设置是否对行进行聚类，这个就见仁见智，看你的实际需求了。当缺失值较多的时候是无法进行聚类的。一个解决办法是读取数据的时候不设置缺失值。
#show_rownames & show_colnames: 是否显示行/列的名称
#treeheight_row & treeheight_col: 当前面设置了聚类之后，两边会出现聚类的树，这个参数是设置树的高度的。
#cellheight & cellwidth: 设置每个各自的宽度和高度。有的时候不设置这两个值画出来的树容易放飞自我????
#cutree_row & cutree_col: 是否根据聚类情况把树切开，可以设置切开的份数。
#display_numbers: 设置是否显示每个单元格的值。这个也是个人喜好及文章需求。
#legend: 设置是否显示旁边的bar状图例，emmmm好像还没碰到说不要那个玩意儿的情况。。
#filename: 设置输出文件的名字。可以设置的文件类型有：pdf，png，jpg，tiff，bmp

#绘图group_1
heatmap=pheatmap(Group_1,color = cc(1000),
                 main=" ",
                 fontsize = 15,
                 scale="row",
                 border_color = NA,
                 na_col = "grey",
                 cluster_rows = T,cluster_cols = T,
                 show_rownames = T,show_colnames = T,
                 treeheight_row = 30,treeheight_col = 30,
                 cellheight = 15,cellwidth = 30,
                 cutree_row=2,cutree_col=2,
                 display_numbers = F,legend = T,
                 filename = "Group_1.tiff")

#绘图group_2
heatmap=pheatmap(Group_2,color = cc(1000),
                 main=" ",
                 fontsize = 15,
                 scale="row",
                 border_color = NA,
                 na_col = "grey",
                 cluster_rows = T,cluster_cols = T,
                 show_rownames = T,show_colnames = T,
                 treeheight_row = 30,treeheight_col = 30,
                 cellheight = 15,cellwidth = 30,
                 cutree_row=2,cutree_col=2,
                 display_numbers = F,legend = T,
                 filename = "Group_2.tiff")

10. 利用 clusterProfiler包进行GO_KEGG分析

代码如下：

# GO_KEGG -----------------------------------------------------------------

#参考文章：https://www.jianshu.com/p/435d863e0238，

#清空环境变量
rm(list=ls())

#安装包
#BiocManager::install("clusterProfiler")
#BiocManager::install("stringr")
#加载包
library(clusterProfiler)
library(stringr)
library(DOSE)
library(ggplot2)

#clusterProfiler 包里的一些默认作图方法，例如
#barplot(kegg)  #富集柱形图
#dotplot(kegg)  #富集气泡图
#cnetplot(kegg) #网络图展示富集功能和基因的包含关系
#emapplot(kegg) #网络图展示各富集功能之间共有基因关系
#heatplot(kegg) #热图展示富集功能和基因的包含关系
#Barplot画图参数详解:http://blog.sciencenet.cn/blog-1468811-939797.html

#参考物种的基因注释数据库：人类org.Hs.eg.db，果蝇org.Dm.eg.db，拟南芥org.At.tair.db，小鼠org.Mm.eg.db。
#下载参考小鼠的基因注释库
#BiocManager::install("org.Mm.eg.db")
#加载小鼠的基因注释库
library(org.Mm.eg.db)

#准备输入数据
##待分析的数据就是一串基因名称，可以是ensembl_id、entrze_id或者symbol_id等类型
##读入差异基因的列表（此处根据daizhongye的实验结果，选取significant_gene[pvalue<0.05,abs(log2FC)>=1]进行作图分析
##对于上调、下调基因，需要手动分割成两个单独文件

#设置工作目录
setwd("G:/daizhongye/RNA-seq/2020_10_29/Rtreatment/significant_different_genes/")

#对group_1样品进行读入
sig.gene_up_group_1 <- read.csv("G:/daizhongye/RNA-seq/2020_10_29/Rtreatment/significant_different_genes/significant_pvalue_different_genes_group_1_genecount_up.csv")
sig.gene_dn_group_1 <- read.csv("G:/daizhongye/RNA-seq/2020_10_29/Rtreatment/significant_different_genes/significant_pvalue_different_genes_group_1_genecount_down.csv")

#对group_2样品进行读入
sig.gene_up_group_2 <- read.csv("G:/daizhongye/RNA-seq/2020_10_29/Rtreatment/significant_different_genes/significant_pvalue_different_genes_group_2_genecount_up.csv")
sig.gene_dn_group_2 <- read.csv("G:/daizhongye/RNA-seq/2020_10_29/Rtreatment/significant_different_genes/significant_pvalue_different_genes_group_2_genecount_down.csv")

##提取差异基因的列表
gene_up_group_1 <- sig.gene_up_group_1$X
gene_dn_group_1 <- sig.gene_dn_group_1$X

gene_up_group_2 <- sig.gene_up_group_2$X
gene_dn_group_2 <- sig.gene_dn_group_2$X

##调整数据格式为字符
gene_up_group_1 <- as.character(gene_up_group_1)
gene_dn_group_1 <- as.character(gene_dn_group_1)

gene_up_group_2 <- as.character(gene_up_group_2)
gene_dn_group_2 <- as.character(gene_dn_group_2)

##对基因由SYMBOL转换为ENTREZID格式
##select(x, keys, columns, keytype, ...)：基于keys, columns和keytype以data.frame数据类型返回数据，可以是一对多的关系
##mapIds(x, keys, column, keytype, ..., multiVals)： 类似于select，只不过就返回一个列。
gene_up_group_1.df <- select(org.Mm.eg.db,           #小鼠基因注释库
                             keys = gene_up_group_1,  #样品组信息
                             columns = "ENTREZID",    #指定基因名称类型
                             keytype ="SYMBOL")       #输入的基因名称类型

gene_dn_group_1.df <- select(org.Mm.eg.db,           #小鼠基因注释库
                             keys=gene_dn_group_1,    #样品组信息
                             columns = "ENTREZID",    #指定基因名称类型
                             keytype="SYMBOL")        #输入的基因名称类型

gene_up_group_2.df <- select(org.Mm.eg.db,           #小鼠基因注释库
                             keys=gene_up_group_2,    #样品组信息
                             columns = "ENTREZID",    #指定基因名称类型
                             keytype="SYMBOL")        #输入的基因名称类型

gene_dn_group_2.df <- select(org.Mm.eg.db,           #小鼠基因注释库
                             keys=gene_dn_group_2,    #样品组信息
                             columns = "ENTREZID",    #指定基因名称类型
                             keytype="SYMBOL")        #输入的基因名称类型

#GO富集分析
GO_BP_group_1_up <- enrichGO(gene= gene_up_group_1.df$ENTREZID, #基因列表文件中的基因名称
                             OrgDb = org.Mm.eg.db,               #指定物种的基因数据库，此为小鼠
                             keyType = "ENTREZID",               #指定给定的基因名称类型，此为symbol_id
                             ont = "BP",                         #可选BP、MF、CC，也可以指定 ALL 同时计算 3 者
                             pAdjustMethod = "BH",               #指定p值校正方法
                             pvalueCutoff = 0.05,                #指定p值阈值，不显著的值将不显示在结果中
                             qvalueCutoff = 0.2,                 #指定q值阈值，不显著的值将不显示在结果中
                             readable = TRUE)                    #whether mapping gene ID to gene Name
# minGSSize                         minimal size of genes annotated by Ontology term for testing.
# maxGSSize                         maximal size of genes annotated for testing
# pool                              If ont=’ALL’, whether pool 3 GO sub-ontologies

GO_BP_group_1_dn <- enrichGO(gene= gene_dn_group_1.df$ENTREZID, #基因列表文件中的基因名称
                             OrgDb = org.Mm.eg.db,               #指定物种的基因数据库，此为小鼠
                             keyType = "ENTREZID",               #指定给定的基因名称类型，此为symbol_id
                             ont = "BP",                         #可选BP、MF、CC，也可以指定 ALL 同时计算 3 者
                             pAdjustMethod = "BH",               #指定p值校正方法
                             pvalueCutoff = 0.05,                #指定p值阈值，不显著的值将不显示在结果中
                             qvalueCutoff = 0.2,                 #指定q值阈值，不显著的值将不显示在结果中
                             readable = TRUE)                    #whether mapping gene ID to gene Name 
# minGSSize                         minimal size of genes annotated by Ontology term for testing.
# maxGSSize                         maximal size of genes annotated for testing
# pool                              If ont=’ALL’, whether pool 3 GO sub-ontologies

GO_BP_group_2_up <- enrichGO(gene= gene_up_group_2.df$ENTREZID, #基因列表文件中的基因名称
                             OrgDb = org.Mm.eg.db,               #指定物种的基因数据库，此为小鼠
                             keyType = "ENTREZID",               #指定给定的基因名称类型，此为symbol_id
                             ont = "BP",                         #可选BP、MF、CC，也可以指定 ALL 同时计算 3 者
                             pAdjustMethod = "BH",               #指定p值校正方法
                             pvalueCutoff = 0.05,                #指定p值阈值，不显著的值将不显示在结果中
                             qvalueCutoff = 0.2,                 #指定q值阈值，不显著的值将不显示在结果中
                             readable = TRUE)                    #whether mapping gene ID to gene Name
# minGSSize                         minimal size of genes annotated by Ontology term for testing.
# maxGSSize                         maximal size of genes annotated for testing
# pool                              If ont=’ALL’, whether pool 3 GO sub-ontologies

GO_BP_group_2_dn <- enrichGO(gene= gene_dn_group_2.df$ENTREZID, #基因列表文件中的基因名称
                             OrgDb = org.Mm.eg.db,               #指定物种的基因数据库，此为小鼠
                             keyType = "ENTREZID",               #指定给定的基因名称类型，此为symbol_id
                             ont = "BP",                         #可选BP、MF、CC，也可以指定 ALL 同时计算 3 者
                             pAdjustMethod = "BH",               #指定p值校正方法
                             pvalueCutoff = 0.05,                #指定p值阈值，不显著的值将不显示在结果中
                             qvalueCutoff = 0.2,                 #指定q值阈值，不显著的值将不显示在结果中
                             readable = TRUE)                    #whether mapping gene ID to gene Name
# minGSSize                         minimal size of genes annotated by Ontology term for testing.
# maxGSSize                         maximal size of genes annotated for testing
# pool                             If ont=’ALL’, whether pool 3 GO sub-ontologies


#对GO富集分析的结果进行输出保存
#设置工作目录
setwd("G:/daizhongye/RNA-seq/2020_10_29/Rtreatment/GO_KEGG/")

write.csv(as.data.frame(GO_BP_group_1_up), "GO_BP_group_1_up.csv")
write.csv(as.data.frame(GO_BP_group_1_dn), "GO_BP_group_1_dn.csv")
write.csv(as.data.frame(GO_BP_group_2_up), "GO_BP_group_2_up.csv")
write.csv(as.data.frame(GO_BP_group_2_dn), "GO_BP_group_2_dn.csv")

#对GO富集分析进行绘图并输出保存
tiff("GO_BP_group_1_up.tiff")
barplot(GO_BP_group_1_up, showCategory = 16,title="The GO_BP enrichment analysis of all DEGs ") + 
  scale_size(range=c(2, 12))+
  scale_x_discrete(labels=function(GO_BP_group_1_up) str_wrap(GO_BP_group_1_up, width = 30))
dev.off()

tiff("GO_BP_group_1_dn.tiff")
barplot(GO_BP_group_1_dn, showCategory = 16,title="The GO_BP enrichment analysis of all DEGs ") + 
  scale_size(range=c(2, 12))+
  scale_x_discrete(labels=function(GO_BP_group_1_dn) str_wrap(GO_BP_group_1_dn, width = 30))
dev.off()

tiff("GO_BP_group_2_up.tiff")
barplot(GO_BP_group_2_up, showCategory = 16,title="The GO_BP enrichment analysis of all DEGs ") + 
  scale_size(range=c(2, 12))+
  scale_x_discrete(labels=function(GO_BP_group_2_up) str_wrap(GO_BP_group_2_up, width = 30))
dev.off()

tiff("GO_BP_group_2_dn.tiff")
barplot(GO_BP_group_2_dn, showCategory = 16,title="The GO_BP enrichment analysis of all DEGs ") + 
  scale_size(range=c(2, 12))+
  scale_x_discrete(labels=function(GO_BP_group_2_dn) str_wrap(GO_BP_group_2_dn, width = 30))
dev.off()


#KEGG富集分析
#clusterProfiler的KEGG富集分析方法特殊，它无需加载本地注释库，
#自动使用KEGG的在线数据库进行注释，因此给定的基因名称只能识别entrze id。
#每次打开R计算时，它会自动连接kegg官网获得最近的物种注释信息，因此数据库一定都是最新的

KEGG_group_1_up <- enrichKEGG( gene = gene_up_group_1.df$ENTREZID,   #基因列表文件中的基因名称
                               keyType = 'kegg',                      #kegg 富集
                               organism = 'mmu',                      #物种，mmu 代表小鼠，hsa代表人类，oas代表绵羊
                               pAdjustMethod = 'BH',                  #指定 p 值校正方法
                               pvalueCutoff = 0.05,                   #指定 p 值阈值，不显著的值将不显示在结果中
                               qvalueCutoff = 0.2,                    #指定 q 值阈值，不显著的值将不显示在结果中
                               use_internal_data= FALSE )

KEGG_group_1_dn <- enrichKEGG( gene = gene_dn_group_1.df$ENTREZID,   #基因列表文件中的基因名称
                               keyType = 'kegg',                      #kegg 富集
                               organism = 'mmu',                      #物种，mmu 代表小鼠，hsa代表人类，oas代表绵羊
                               pAdjustMethod = 'BH',                  #指定 p 值校正方法
                               pvalueCutoff = 0.05,                   #指定 p 值阈值，不显著的值将不显示在结果中
                               qvalueCutoff = 0.2,                    #指定 q 值阈值，不显著的值将不显示在结果中
                               use_internal_data= FALSE )

KEGG_group_2_up <- enrichKEGG( gene = gene_up_group_2.df$ENTREZID,   #基因列表文件中的基因名称
                               keyType = 'kegg',                      #kegg 富集
                               organism = 'mmu',                      #物种，mmu 代表小鼠，hsa代表人类，oas代表绵羊
                               pAdjustMethod = 'BH',                  #指定 p 值校正方法
                               pvalueCutoff = 0.05,                   #指定 p 值阈值，不显著的值将不显示在结果中
                               qvalueCutoff = 0.2,                    #指定 q 值阈值，不显著的值将不显示在结果中
                               use_internal_data= FALSE )

KEGG_group_2_dn <- enrichKEGG( gene = gene_dn_group_2.df$ENTREZID,   #基因列表文件中的基因名称
                               keyType = 'kegg',                      #kegg 富集
                               organism = 'mmu',                      #物种，mmu 代表小鼠，hsa代表人类，oas代表绵羊
                               pAdjustMethod = 'BH',                  #指定 p 值校正方法
                               pvalueCutoff = 0.05,                   #指定 p 值阈值，不显著的值将不显示在结果中
                               qvalueCutoff = 0.2,                    #指定 q 值阈值，不显著的值将不显示在结果中
                               use_internal_data= FALSE )

#KEGG分析结果各列内容：
#ID和Description，富集到的KEGG id和描述；
#GeneRatio和BgRatio，分别为富集到该KEGG条目中的基因数目/给定基因的总数目，以及该条目中背景基因总数目/该物种所有已知的KEGG功能基因数目；
#pvalue、p.adjust和qvalue，p值、校正后p值和q值信息；
#geneID和Count，富集到该KEGG条目中的基因名称（分析中使用的entrze id，故这里也显示的entrze id）和数目。
#如期望显示其它类型的基因id，如通俗的symbol id等类型，由于该分析中只能输入entrze id，因此可以通过基因名称转换的方式对entrze id和symbol id作个匹配转换。

#输出结果
write.table(KEGG_group_1_up, 'KEGG_group_1_up.csv', sep = ',', quote = FALSE, row.names = FALSE)
write.table(KEGG_group_1_dn, 'KEGG_group_1_dn.csv', sep = ',', quote = FALSE, row.names = FALSE)
write.table(KEGG_group_2_up, 'KEGG_group_2_up.csv', sep = ',', quote = FALSE, row.names = FALSE)
write.table(KEGG_group_2_dn, 'KEGG_group_2_dn.csv', sep = ',', quote = FALSE, row.names = FALSE)

#将输出结果的"ENTREZID"转为"SYMBOL"
#读取数据

#对group_1_up的gene进行名称类型转换
KEGG_group_1_up_df <- read.csv("KEGG_group_1_up.csv") 
#查看文件的整体信息以确认需要转换的列
KEGG_group_1_up_df
#with({})函数中的花括号语句，只针对括号内的语句执行，无需担心名字的冲突
#with()函数局限性在于赋值仅在此函数的括号内生效
with(KEGG_group_1_up_df, {
  gene = NA    #对变量gene进行一个定义
  for (i in 1:nrow(KEGG_group_1_up_df))        #for（i in seq)语句做循环，#nrow()对数据取行数
  {
    aaa = unlist(str_split(KEGG_group_1_up_df$geneID[i],"/"))  #str_split函数对字符串进行拆分，unlist函数将拆分的数据合并
    gene = c(gene, aaa)      #将所有的拆分结果合并在一起
  }
  KEGG_gene_group_1_up <<- gene[-1]        #对最开始的gene赋值进行剔除
})
#查看最终提取结果
KEGG_gene_group_1_up
#对提取的"ENTREZID"利用select()函数进行转换
#使用birt()函数也可以对ID和symbol进行转换，但是对于重复ID不再进行重复输出
KEGG_gene_group_1_up <- select(org.Mm.eg.db,              #小鼠基因注释库
                               keys=KEGG_gene_group_1_up,  #样品组信息
                               columns = "SYMBOL",         #指定基因名称类型
                               keytype="ENTREZID")         #输入的基因名称类型
#查看最终转换结果
KEGG_gene_group_1_up


#对group_1_dn的gene进行名称类型转换
KEGG_group_1_dn_df <- read.csv("KEGG_group_1_dn.csv") 
#查看文件的整体信息以确认需要转换的列
KEGG_group_1_dn_df
#with({})函数中的花括号语句，只针对括号内的语句执行，无需担心名字的冲突
#with()函数局限性在于赋值仅在此函数的括号内生效
with(KEGG_group_1_dn_df, {
  gene = NA    #对变量gene进行一个定义
  for (i in 1:nrow(KEGG_group_1_dn_df))        #for（i in seq)语句做循环，#nrow()对数据取行数
  {
    aaa = unlist(str_split(KEGG_group_1_dn_df$geneID[i],"/"))  #str_split函数对字符串进行拆分，unlist函数将拆分的数据合并
    gene = c(gene, aaa)      #将所有的拆分结果合并在一起
  }
  KEGG_gene_group_1_dn <<- gene[-1]        #对最开始的gene赋值进行剔除
})
#查看最终提取结果
KEGG_gene_group_1_dn
#对提取的"ENTREZID"利用select()函数进行转换
#使用birt()函数也可以对ID和symbol进行转换，但是对于重复ID不再进行重复输出
KEGG_gene_group_1_dn <- select(org.Mm.eg.db,              #小鼠基因注释库
                               keys=KEGG_gene_group_1_dn,  #样品组信息
                               columns = "SYMBOL",         #指定基因名称类型
                               keytype="ENTREZID")         #输入的基因名称类型
#查看最终转换结果
KEGG_gene_group_1_dn


#对group2_up的gene进行名称类型转换
KEGG_group_2_up_df <- read.csv("KEGG_group_2_up.csv") 
#查看文件的整体信息以确认需要转换的列
KEGG_group_2_up_df
#with({})函数中的花括号语句，只针对括号内的语句执行，无需担心名字的冲突
#with()函数局限性在于赋值仅在此函数的括号内生效
with(KEGG_group_2_up_df, {
  gene = NA    #对变量gene进行一个定义
  for (i in 1:nrow(KEGG_group_2_up_df))        #for（i in seq)语句做循环，#nrow()对数据取行数
  {
    aaa = unlist(str_split(KEGG_group_2_up_df$geneID[i],"/"))  #str_split函数对字符串进行拆分，unlist函数将拆分的数据合并
    gene = c(gene, aaa)      #将所有的拆分结果合并在一起
  }
  KEGG_gene_group_2_up <<- gene[-1]        #对最开始的gene赋值进行剔除
})
#查看最终提取结果
KEGG_gene_group_2_up
#对提取的"ENTREZID"利用select()函数进行转换
#使用birt()函数也可以对ID和symbol进行转换，但是对于重复ID不再进行重复输出
KEGG_gene_group_2_up <- select(org.Mm.eg.db,              #小鼠基因注释库
                               keys=KEGG_gene_group_2_up,  #样品组信息
                               columns = "SYMBOL",         #指定基因名称类型
                               keytype="ENTREZID")         #输入的基因名称类型
#查看最终转换结果
KEGG_gene_group_2_up


#对group2_dn的gene进行名称类型转换
KEGG_group_2_dn_df <- read.csv("KEGG_group_2_dn.csv") 
#查看文件的整体信息以确认需要转换的列
KEGG_group_2_dn_df
#with({})函数中的花括号语句，只针对括号内的语句执行，无需担心名字的冲突
#with()函数局限性在于赋值仅在此函数的括号内生效
with(KEGG_group_2_dn_df, {
  gene = NA    #对变量gene进行一个定义
  for (i in 1:nrow(KEGG_group_2_dn_df))        #for（i in seq)语句做循环，#nrow()对数据取行数
  {
    aaa = unlist(str_split(KEGG_group_2_dn_df$geneID[i],"/"))  #str_split函数对字符串进行拆分，unlist函数将拆分的数据合并
    gene = c(gene, aaa)      #将所有的拆分结果合并在一起
  }
  KEGG_gene_group_2_dn <<- gene[-1]        #对最开始的gene赋值进行剔除
})
#查看最终提取结果
KEGG_gene_group_2_dn

#对提取的"ENTREZID"利用select()函数进行转换
#使用birt()函数也可以对ID和symbol进行转换，但是对于重复ID不再进行重复输出
KEGG_gene_group_2_dn <- select(org.Mm.eg.db,              #小鼠基因注释库
                               keys=KEGG_gene_group_2_dn,  #样品组信息
                               columns = "SYMBOL",         #指定基因名称类型
                               keytype="ENTREZID")         #输入的基因名称类型
#查看最终转换结果
KEGG_gene_group_2_dn


#对转换后的结果输出保存
write.table(KEGG_gene_group_1_up, 'KEGG_gene_group_1_up.csv', sep = ',', quote = FALSE, row.names = FALSE)
write.table(KEGG_gene_group_1_dn, 'KEGG_gene_group_1_dn.csv', sep = ',', quote = FALSE, row.names = FALSE)

write.table(KEGG_gene_group_2_up, 'KEGG_gene_group_2_up.csv', sep = ',', quote = FALSE, row.names = FALSE)
write.table(KEGG_gene_group_2_dn, 'KEGG_gene_group_2_dn.csv', sep = ',', quote = FALSE, row.names = FALSE)


#对KEGG富集分析的结果进行输出保存
tiff("KEGG_group_1_up.tiff")
barplot(KEGG_group_1_up, showCategory = 16,title="The KEGG enrichment analysis of all DEGs ") + 
  scale_size(range=c(2, 12))+
  scale_x_discrete(labels=function(KEGG_group_1_up) str_wrap(KEGG_group_1_up, width = 30))
dev.off()

tiff("KEGG_group_1_dn.tiff")
barplot(KEGG_group_1_dn, showCategory = 16,title="The KEGG enrichment analysis of all DEGs ") + 
  scale_size(range=c(2, 12))+
  scale_x_discrete(labels=function(KEGG_group_1_dn) str_wrap(KEGG_group_1_dn, width = 30))
dev.off()

tiff("KEGG_group_2_up.tiff")
barplot(KEGG_group_2_up, showCategory = 16,title="The KEGG enrichment analysis of all DEGs ") + 
  scale_size(range=c(2, 12))+
  scale_x_discrete(labels=function(KEGG_group_2_up) str_wrap(KEGG_group_2_up, width = 30))
dev.off()

tiff("KEGG_group_2_dn.tiff")
barplot(KEGG_group_2_dn, showCategory = 16,title="The KEGG enrichment analysis of all DEGs ") + 
  scale_size(range=c(2, 12))+
  scale_x_discrete(labels=function(KEGG_group_2_dn) str_wrap(KEGG_group_2_dn, width = 30))
dev.off()