ECFP、FCFP和SMILES的内在原理

指纹是一种非常有用的低分辨率的分子表征，其形式多种多样。在过去几十年中，指纹已被应用于解决各种问题。扩展连通性指纹（Extended Connectivity Fingerprints，ECFP）是当下最广受使用用于构建化合物定量构效关系（QSAR）模型的分子指纹。

ECFP 于 2000 年随着 Pipeline Pilot 的发布而首次引入。在 RDKit 中，ECFP 指纹又叫 Morgan 指纹，其原因为ECFP的核心思想来自于 Morgan 算法，该算法试图为分子中的每个原子分配一个唯一的、连续的编号。独特的原子编号是所有广泛使用的分子识别方法（包括InChI、SMILES、CAS registry等）的基础。

需要注意的是：以下“编号”实际对应的英文名为Identifier，也就是标识符，是指用来标识某个实体的一个符号，在不同的应用环境下有不同的含义。“编号”不仅仅是1、2、3、4、5，这里为了好理解，均翻译为编号。

1. Morgan算法的原理
Morgan 算法名字来源于1965年 Morgan 发表的论文，该算法分两步进行：
**第一步：**枚举所有可能的原子编号，遵循规则为：
（1）开始位置随机：
如下面图片所示，选择一个随机原子并标记为“1”。
（2）遵照一定的顺序，相邻原子编号相连：
原子1的每个未标记的相邻原子都按随机顺序迭代，并分配给该原子下一个最高的可用数字（“2”、“3”，以此类推）。例如，如果选择了A为1，B就是2。如果选择B为1，A、C、D均可以为2，如果A为2，C和D其中一个为3；如果C为3，则D为4；如果D为3，则C为4。
（3）每个原子只分配一个唯一的编号：
每个新标记的原子按照其编号进行迭代，并按照步骤2对其相邻原子进行编号。这个过程一直持续到所有原子都被编号为止，其结果是分子中的每个原子都有一个唯一的编号。

图1 例子

如上图所示，可能出现12种分配方案

图2 分配方案

**第二步：**将上述所有的分配方案进行一一去除，直到只剩下一种分配方案。
在去除时，需要计算每个原子的连通性（Connectivity value），这也是扩展连通性指纹命名的由来。连通性，简单来说就是原子的连接情况。如何计算原子的连通性呢？首先，分子中的每个原子被分配一个初始的 “连接值”，如下图设置为1。然后，进行迭代，用一个新的"连接值"取代之前的"连接值"，这个新的"连接值"是由相邻的"连接值"之和计算出来的。如下面例子，values为这些"连接值"的多样性，即多少个唯一的值，当 values开始下降则停止迭代。如下图的例子，当 n为6时，发现 values不再变化，则使用n=6的情况。
最后一轮的"连接值"被用来消除分配方案，最终使得分子中原子都具有唯一的原子编号。如下图，按照蓝色箭头右边的顺序分配原子的序号，比如最右边的C为第1位，接着是与之相连的C（3），在这个分叉口，如果按照随机原则，我们可以选择双键的O，也可以选择单键的O。但是，有了这个优先级，我们可以确定直接用双键O（1），因为双键O（1）的顺序要由于单键O（9）。

图3 如何去除分配方案

我们可以根据这个不变量来构建smiles

但是，Morgan算法也有些不足的地方：
（1）不变量非常简单
（2）最初无法区分不同原子类型的键序
（3）数值爆炸
（4）并不是所有的原子都能被很好地区分……

Weininger et al.等人提出了CANGEN 算法来克服这些不足：
（1）改进的不变量
（2）“稳定”优先级
（3）避免组合不变量引起的歧义
（4）解决“对称”原子

类似的程序用于通过 CANGEN 算法生成唯一的 SMILES。然而，在这种情况下，分配给每个原子的初始值要考虑到以下的原子不变量：
（1）原子连接数。
（2）非氢键的数量。
（3）原子数。
（4）电荷的符号。
（5）绝对电荷。
（6）连接氢的数量。
这些属性可以方便地被编码为整数值。尽管CANGEN论文中使用的术语是 “不变”，在本文中这些值将被称为 “原子标识符”（个人定义，原子编号）。我们以下结构为例介绍如何通过 CANGEN 算法生成唯一的 SMILES。
图4 起始不变量

图5 起始不变量转变为排序（rank），ranks为每一条数据的多样性，即多少个唯一的值。共有（a和m）、b、l、（c、d、i和k）、（e、f、g、h）、j六种唯一的值。

图6 对不变量更新规则

图7 得到新的排序（new rank）





图8 重复，直到新的排序稳定

图9 生成smiles

2. ECFP的原理

ECFP是一种环形指纹（Circular fingerprint)，术语 "扩展连接 "（Extended Connectivity）和 "环状 "（Circular）暗示了ECFP和Morgan算法之间的潜在联系。在ECFP中，分子中的每个原子都可以被看作是一个环形的中心。我们可以通过首先检查某原子相邻的原子，然后是这些相邻原子的相邻原子，依此类推，迭代地收集该原子的信息。然而，生成ECFP的算法在两个重要方面与Morgan的算法不同：

1. 存储中间原子的原子编号。
2. 不需要一组完全唯一的原子编号，这使得我们可以进行进一步优化。

一个 ECFP 被定义为每个感知半径的所有原子编号的集合，直到极限 n。 随着感知半径的扩大（n 增加），这个集合包括在以前和当前迭代中发现的所有原子编号。例如，n=0时，ECFP由一组唯一的原子编号组成，也就是说只考虑原子本身。n=1 时，我们检查每个原子及其直接相邻原子，来计算原子编号，从而扩充 n=0 的集合，以组成n=1的 ECFP。n增大时，依此类推。n=1 时称之 ECFP_2，n=2 时为 ECFP_4，以此类推。

图10 感知半径的意义

迭代更新对原子编号表示的信息的影响的说明。 在这里，我们考虑苯甲酸酰胺中的原子 1。 如图顶部所示，每次迭代的效果是创建一个原子编号，该编号代表中心原子周围越来越大的圆形子结构。 在第 0 次迭代（即初始原子编号）时，原子仅表示有关原子 1 及其连接的键的信息，并且可以由左下角的子结构表示（“A”表示除氢以外的任何类型的原子）。经过一次迭代，原子编号现在包含有关原子 1 的直接相邻原子的信息（如图底部中心子结构所示）。 经过两次迭代，所代表的子结构进一步增长，现在完全结合了酰胺基团以及大部分芳环，如右下角所示。

因此，ECFP原子编号可以被看作是一种特殊的子结构钥匙。这里，"子结构 "指的是一个中心原子和它的相邻原子（该相邻原子按照与中心原子的距离分组）。一个密钥的存在表明，相应的分子包含产生该密钥的子结构。
可以使用任何方便的方法来存储原子编号。 例如，某些应用程序可能使用类似集合的数据结构，例如 ES6 和 Python 中的 Set 类或 Java 的 java.util.Set 实现提供的数据结构。另外，也可以使用概率性的二进制数据结构，如布鲁姆过滤器等。

3. 计算ECFP

ECFP 计算分三个阶段进行：
（1）初始化。即给每个原子都分配一个整数编号。
（2）迭代更新。将该原子的相邻原子信息增加到该原子上。
（3）重复处理。同一特征的多个实例要么被删除，要么被计数。

仅仅从这个描述中就可以开发出简单的ECFP算法。例如，我们可以将ECFP建立在原子质量上。在步骤1中，我们将分子中每个原子的质量存储在一个集合中。这个集合成为Iteration 0（迭代0）的ECFP。

Iteration 1的ECFP可以通过继续该算法来准备。在已经获得的原子集上，我们再增加一组，该组由中心原子的原子质量和其近邻原子的质量之和组成。

根据具体的应用，重复的原子编号可能会被删除或计数。例如，如果一个应用只要求记录一个原子编号的存在，则可以删除重复项。另一方面，如果一个应用要求计算原子编号的出现次数，则可以使用计数器。

我们可以迭代地继续添加原子编号，直到任意感知半径 n。请注意，随着 n 的增加，每个原子编号携带的原子信息离中心原子越来越远。

ECFP的计算步骤

上一节中描述的简化算法省略了很多潜在的有用信息。在实践中，ECFP原子编号不仅仅是原子质量，还有其他更广泛的各种属性。下面是一种ECFP生成算法，可以处理任意的原子和键的属性：
（1）创建一个集合 (S)，用于存储原子编号。
（2）使用32位的整数来标记每个原子，比如可以使用 Morgan 算法或者 CANGEN 算法（确保每个原子有一个唯一的编号），然后将他们哈希化。
（3）将每个原子编号添加到S中。
（4）如果n=0，算法结束。否则继续到步骤（5）。
（5）对于每个原子，创建一个“键列表”储存该原子周边原子的信息，该列表先根据键级（单键、双键、三建）排序，再根据周边原子编号大小排序。
（6）用如下信息填充上述列表：内容为 [n, identifier, bo1, aid1, bo2, aid2, …]，其中 n 为迭代次数，开始为0，identifier为原子编号，bo1 为第 1 根键的键级，aid1 是第 1 根键所连原子的编号。
（7）计算第 6 步中的特征列表的哈希值，作为该原子新的编号。
（8）如果新算出的编号在结构上与 S 中的不重复，则加入到 S 中。
（9）如果 n>=2，则重复5的步骤，进入下一个迭代。

这里所谓结构上不重复，原论文给出了一个例子，从 O 出发和从 N 出发，当 n=2 时，都会出现图中圈出的子结构，由于他们“起始”原子不同，所以原子编号肯定也不同，但从结构的角度，他们是一样的，所以需要去除。

图11 重复结构

以氧（左）和氮（右）为中心进行两次迭代后的特征区域。由于这两个区域包含完全相同的原子和化学键，它们代表了重复的信息，尽管它们hash的原子编号值不同。

图12 丁酰胺的特征在去除重复后所代表的结构。该分子在初始赋值阶段产生五个特征（即唯一的原子标识符），在一次迭代后产生六个额外的特征，在两次迭代后产生三个特征。进一步的迭代没有产生新的特征。(图中的中心原子通过显示其原子编号来表示）。

4. Hash功能

Rogers和Hahn对要使用的哈希函数的问题有这样的说法。我们不描述在我们的计算中使用的特定哈希函数，因为任何 "合理的 "哈希函数都可以使用，而且结果的科学性是相同的。最重要的是让哈希函数将整数数组随机、均匀地映射到所有可能的整数的232大小的空间中；如果没有均匀的覆盖，碰撞率可能会增加，导致信息的损失。

换句话说，所需要的只是一个能够生成在足够大范围内均匀分布的标识符（编号）的哈希函数。

一个很好的候选者是循环冗余检查（CRC）函数之一，如广泛使用的CRC-32。这个哈希函数是由Alex Clark首次明确记录的，用于化学开发工具包的循环指纹实现。

CRC-32给定一个任意的字节数组，返回一个有符号的32位整数。大多数语言都有相应的实现。例如，CRC-32 Node JS包的工作原理如下。

一个很好的候选是循环冗余校验（CRC）函数之一，例如广泛使用的 CRC-32。这个散列函数首先由 Alex Clark 明确记录，用于化学开发工具包的环状指纹实施。

给定任意字节数组，CRC-32 返回一个有符号的 32 位整数。大多数语言都有实现。例如，CRC-32 Node JS 包的工作原理如下：

import hash from 'crc-32';

const feature = [ 1, 2, 3, 4 ];
const identifier = hash.buf(feature); // -1237517363

5. 联想

像任何指纹的实现一样，ECFP需要特别注意联想形式。特别是，必须为同一分子的所有联想形式生成相同的 ECFP。有两种概念上的方法是可行的：
（1）在计算 ECFP 指纹之前找到一个规范的联想形式。
（2）避免使用明确的键信息。

在这两种方法中，（2）似乎是最实用的。例如，对上面概述的针对键的算法做两点改变就可以消除联想形式简并。首先，确保原子不变量的计算包括原子的不饱和度。 其次，将步骤（6）替换为：
用如下信息填充上述列表：内容为 [n, identifier, aid1, aid2, …]，其中 n 为迭代次数，开始为0，identifier为原子编号，aid1 是第 1 根键所连原子的编号。（我理解就是去掉了键的信息）

6. FCFP
如前一节所述，基本的 ECFP 算法可以进行修改。 “功能类指纹”（FCFPs，Functional-Class Fingerprints）与 ECFP 类似，都是通过迭代的方式将原子周围环境编译成一个分子指纹，与 ECFP 不同的是初始化时的原子特征。在 ECFP 中，原子的初始编号使用 CANGEN 算法中的方法，即由原子本身的几个性质得到，包括：
（1）原子连接数
（2）非氢化学键数
（3）原子序号
（4）原子电荷正负
（5）原子电荷绝对值
（6）连接氢原子个数
RDKit 中具体实现方法仅仅是用了（1）、（3）、（5）和（6）

FCFP使用了一个六位编码，其中设置一个位表示存在一个 "药效 "属性，这些"药效 "属性很像药物化学中的药效团，：
（1）氢键受体；
（2）氢键供体；
（3）负离子化；
（4）可正离子化；
（5）芳香原子；以及
（6）卤素
类似的方法可用于根据其他特征类的存在来分配原子编号，包括图形属性（例如，ring membership、氢的数量或立体化学构型）或物理属性（例如，pKa、电负性、同位素质量）。

RDKit 使用预先定义的 SMARTS来匹配该原子是否满足上述六种性质。可见 FCFP 所描述的原子本身信息更少，仅仅是描述原子所处的官能团环境，随着迭代的过程，FCFP 似乎在描述几个官能团之间的拓扑关系，比如 FCFP4 将反映距离为2根键内的药效团组合，如 O=C-Cl 这样。

7. 总结

ECFP主要有三个特点，这些特点最能反映出其优势：
（1）简单性。基本的ECFP算法是由很少的单元组成的，实现简单。
（2）灵活性。基本算法的许多变化都是可能的。
（3）易于计算。感知半径可以改变，以便在计算的复杂性和功能之间取得平衡。

参考文章：

1. https://www.zealseeker.com/archives/ecfp-introduction/
2. https://depth-first.com/articles/2019/01/11/extended-connectivity-fingerprints/#hash-function
   3.https://bigchem.eu/sites/default/files/Martin_Vogt_algorithms_in_cheminformatics_150519.pdf
3. Rogers, David Hahn, Mathew. Extended-connectivity fingerprints. Journal of Chemical Information and Modeling. 2010.50(5).742-754.