多重荧光免疫组化（mIHC）实验原理
多重荧光免疫组化
主要采用的是TSA技术，又称之为络胺信号放大技术；简单来说就是用该方法做多重免疫荧光是利用二抗上带有的HRP（而不是直接偶联荧光素）来催化后续添加茹体系的非活性荧光素。
荧光素在HRP和过氧化氢的作用下被活化，跟临近蛋白的酪氨酸残基共价偶联，使得蛋白样品与荧光素稳定的结合。
然后利用微波的处理，前一轮非共价结合的抗体被洗掉，共价结合的荧光素还残留在样品上。再换一个一抗来进行第二轮的孵育，周而复始。等到所有的抗体孵育结束以后，荧光素都结合好以后，最后对结果进行检测。
由于每一体系中都只有单一抗体孵育，因此无需要担心抗体的交叉反应以及一抗二抗种属匹配的问题，大大减少了实验设计时不同种属抗体选择匹配的限制。也就是说，如果使用TSA技术，同一张片子上所有靶标都可以用特异性高的兔单克隆抗体，搭配同一支抗兔的HRP二抗就可以进行实验，而且信号放大倍数大大增强。
荧光法多重免疫组化，可同时进行五个颜色通道以上，这种情况发射的光谱会重叠，我们可以借助多光谱成像系统来解决这一个问题。
使用TSA技术，你需要准备
- 严格验证的高特异性抗体：所有CST的IHC-P验证过的抗体均满足mIHC（多重荧光免疫组化）高特异性的要求。
- HRP偶联的针对一抗种属亚型特异的二抗
- 酪胺荧光素
- 多光谱成像系统
多重荧光免疫组化（mIHC）实验操作步骤
- 切片托拉，复水
- 抗原修复
- 抗体浓度的优化
- 染色
- 拍照分析
流程优化
- 多重染色之前，先摸索单通道下每一个单抗的最佳浓度的范围，以PD-L1为例，通过梯度稀释抗体，测试阴性和阳性样本的荧光强度，计算信噪比（S/N）和最高荧光强度（以每细胞平均荧光强度表示）同时能满足的稀释比例/范围。
- 抗体-荧光素匹配：
高分文章解读
TSA在大肠癌模型表征肿瘤以及免疫细胞
文中采用的多色免疫荧光组化实验步骤：
样本：4μm的FFPE组织切片
重新水化：梯度乙醇
固定：NBF(10％中性缓冲福尔马林)中固定20分钟
抗原修复：微波处理，根据所检测的蛋白，采用pH=6或pH=9的抗原修复液
多重荧光组化抗体的孵育：每支抗体室温孵育30分钟
anti-CD3 (Dako M7254 clone F7.2.38)
anti-FoxP3 (CST 98377S clone D2W8E)
anti-CD20 (Dako M0755 clone L26)
anti-PDL-1 (Biocare Med ACI3171A, C clone Cal10)
anti-Ki67 (Dako M7240 clone MIB-1)
anti-pan cytokeratin (Dako M3515 clone AE1/AE3)
蛋白封闭：每支抗体孵育的环节，采用无血清蛋白封闭15分钟
HRP标记聚合物的孵育：兔/鼠HRP标记聚合物室温孵育15分钟
TSA荧光染料孵育：室温孵育10分钟
Opal 520、Opal 540、Opal 570、Opal 620、Opal 650、Opal 690
抗原修复：每个荧光染料孵育后，进行微波处理，抗原修复液pH=6/pH=9，去除上一轮染色的复合物残留
复染：DAPI室温孵育5分钟
TSA在大肠癌模型中表征T细胞亚群
文中采用的多色免疫荧光组化实验步骤：
样本：FFPE组织切片
抗原修复：pH=6抗原修复液，15分钟
封闭：室温封闭10分钟
抗体孵育：
rabbit anti-human CD3 (Abcam, clone SP7, 1:100)
rabbit anti-human RORγ (Abcam, 1:50)
mouse anti-human FOXP3 (Abcam, clone mAbcam22510, 1:100)
HRP偶联二抗孵育：室温孵育10分钟
信号放大：TSA工作液，室温孵育10分钟)
TC, TH和Treg细胞的四色免疫荧光组化结果
rabbit anti-human CD3 (Abcam, clone SP7, 1:400)
rabbit anti-human CD4 (Abcam, clone EPR6855, 1:400)
mouse anti-human CD8 (Abcam, clone 144B, 1:500)
mouse anti-human FOXP3 (Abcam, clone mAbcam22510, 1:500)
CD8+ TEX细胞多色免疫荧光组化结果
rabbit anti-human TIM-3 (Cell Signalling, clone D5D5R, 1:100)
mouse anti-human Ki67 (Abcam, B126.1, 1:200)
mouse anti-human PD-1 (Abcam, clone NAT105, 1:200)
mouse anti-CD8 (Abcam, clone 144B, 1:200)
TSA在胃癌模型表征肿瘤及巨噬细胞
文中采用的多色免疫荧光组化实验步骤：
样本：4 μm的FFPE组织切片
抗原修复：高压125℃条件，采用pH=8的EDTA修复液孵育3分钟
多重荧光抗体孵育：每支抗体室温孵育30分钟
CD163 (Cell Marque, MRQ-26, 1:500)
CD68 (Leica Biosystems, 514H12, 1:100)
CD206 (Abcam, Ab64693, 1:6000)
IRF8 (Santa Cruz, E-9, 1:3000)
PDL1 (Spring Bioscience, SP142, 1:2000)
multi-cytokeratin (Leica Biosystems, NCL-L-AE1/AE3, 1:200)
CD163之后的抗体孵育，采用pH=8的EDTA修复液，微波15分钟条件进行抗原修复
HRP标记二抗的孵育：兔/鼠HRP标记二抗(1:1000)室温孵育10分钟
TSA染料孵育：1:50室温孵育10分钟
Dye 540、Dye 570、Dye 620、Dye 650、Dye 520、Dye 690
复染：DAPI室温孵育5分钟。
不用mIHC
抗体使用方面：
FCER1G (ab151986, rabbit anti-human polyclonal, 1:400; Abcam)
CD4抗体：重组Anti-CD4抗体[EPR6855] (ab133616)
Produced recombinantly (animal-free) for high batch-to-batch consistency and long term security of supply
Rabbit monoclonal [EPR6855] to CD4
Suitable for: Flow Cyt (Intra), ICC, WB, IHC-P
Reacts with: Human
