三代测序技术简介

现在的第三代测序技术中，主要以PacBio公司的SMRT和Oxford的Nanopore技术为主。与前面的两代技术比较，第三代最主要的特点在于单分子测序，就是测序的过程无需进行PCR扩增了。

1. PacBio SMRT

PacBio SMRT技术的理念在于边合成边测序，并已SMRT芯片为测序载体。原理如下：DNA聚合酶和模板结合，4色荧光标记 4 种碱基（即是dNTP），在碱基配对阶段，不同碱基的加入，会发出不同光，根据光的波长与峰值可判断进入的碱基类型。

这个DNA聚合酶是关键，其活性的保持是实现超长读长的关键之一，主要受到激光对其造成的损伤。SMRT技术的另外一个关键是如何将反应信号和背景信号区别开来。他们利用的是ZMW（零模波导孔）原理：如同微波炉壁上可看到的很多密集小孔。小孔直径有考究，如果直径大于微波波长，能量就会在衍射效应的作用下穿透面板而泄露出来，从而与周围小孔相互干扰。如果孔径小于波长,能量不会辐射到周围，而是保持直线状态（光衍射的原理），从而可起保护作用。同理，在一个反应管(SMRTCell:单分子实时反应孔)中有许多这样的圆形纳米小孔， 即 ZMW(零模波导孔)，外径 100多纳米,比检测激光波长小(数百纳米)，激光从底部打上去后不能穿透小孔进入上方溶液区，能量被限制在一个小范围(体积20X 10-21 L)里，正好足够覆盖需要检测的部分,使得信号仅来自这个小反应区域，孔外过多游离核苷酸单体依然留在黑暗中，从而实现将背景降到最低。

PacBio SMRT测序原理

另外，可以通过检测相邻两个碱基之间的测序时间，来检测一些碱基修饰情况。即如果碱基存在修饰，则通过聚合酶时的速度会减慢，相邻两峰之间的距离增大，可以通过这个来之间检测甲基化等信息。

SMRT技术的测序速度很快，每秒约10个dNTP。但是，同时其测序错误率比较高（这几乎是目前单分子测序技术的通病），达到15%,但好在它的出错是随机的，并不会像第二代测序技术那样存在测序错误的偏向，因而可以通过多次测序来进行有效的纠错。
下面我们再来讲讲PacBio的HiFi（High fidelity reads）模式，相对于CLR（continuous long-read）模式，后者具有更高的准确率和PacBio HiFi模式。

*PacBio HiFi模式

HiFi reads是PacBio公司基于Sequel II平台推出的CCS（Circular Consensus Sequencing）测序模式产生的兼具长读长和高准确度的测序序列，又称CCS reads。在这种测序模式下，因酶读长（平均90-100 Kb）远大于插入片段长度（10-20 Kb），测序时，聚合酶会绕着DNA模板进行环形比对测序，使得插入片段被多次测序，产生多条subreads，来源于同一条模板链的subreads经过一致性校正，最终得到高准确度的HiFi reads，用于基因组组装。

CCS测序产生高质量HiFi reads

HiFi组装优势

• 组装周期短
  PacBio在测序过程中可能会存在10%左右的错误率，在用subreads（CLR模式）做组装时，需要通过算法对测序数据进行自我纠错，提高组装基因组的准确度。相比较而言，用于组装的CCS reads是经过纠错的一致性序列，单孔内CCS准确度高达99%以上，组装时不需要进行自我纠错，节约了纠错所需时间，使得组装周期大大缩短：1天就可以完成普通基因组的组装，对于一些超大基因组，6天即可完成组装。

• 准确度高
  PacBio原始下机数据为polymerase reads，质控后得到subreads，随后会从聚合酶绕插入片段3圈及以上产生的subreads中调取高质量的CCS reads，用于基因组组装。CCS reads本身经过孔内纠错，具有与二代Illunima短reads相当的准确度，有效保证了组装基因组的高准确度。以人基因组为例，与其他测序模式相比，HiFi reads组装基因组的准确度远高于其他组装版本。

  
  
  不同测序模式下组装基因组的质量

• 连续性好
  

  除了组装周期短、序列准确度高，基于HiFi reads组装的基因组也具有较好的连续性。研究人员基于30X HiFi reads对人基因组进行了重新组装，Contig N50达到了77 Mb，组装结果赶超纳米孔测序
  人CHM13细胞系基因组组装结果

较高的准确度使得低深度（25X）的HiFi reads即可满足基因组组装需求，结合一些特异性针对HiFi reads开发的组装软件，能够快速完成一些高杂合或超大型基因组的组装。此外，由于用于组装的数据量较小，且不需要进行三代数据自纠错，使得组装过程中所需的计算资源相对传统CLR模式更少，节约了组装成本。

PacBio SMRT存在的问题
基于之前的测序经验，PacBio SMRT技术，包括不同的模式，对于昆虫和虾蟹这些节肢动物会出现断测现象，就是提早终止测序，导致数据量不足。原因是因为这些节肢动物的基因组的特异性，组蛋白等结合到基因组的蛋白不能很稳定地去除，而基因组序列中如果还结合有其他蛋白，则可能会影响DNA聚合酶的反应，导致碱基无法结合到模板上从而提前终止。

2. Nanopore

Oxford Nanopore Technologies公司所开发的纳米单分子测序技术与以往的测序技术皆不同，它是基于电信号而不是光信号的测序技术。该技术的关键之一是，他们设计了一种特殊的纳米孔，孔内共价结合有分子接头。当DNA碱基通过纳米孔时，它们使电荷发生变化，从而短暂地影响流过纳米孔的电流强度（每种碱基所影响的电流变化幅度是不同的），灵敏的电子设备检测到这些变化从而鉴定所通过的碱基。纳米孔测序（和其他第三代测序技术）有望解决目前测序平台的不足，纳米孔测序的主要特点是：读长很长，大约在几十kb，甚至100 kb；错误率目前介于1%至4%，且是随机错误，而不是聚集在读取的两端;数据可实时读取；通量很高(30x人类基因组有望在一天内完成)；起始DNA在测序过程中不被破坏；以及样品制备简单又便宜。理论上，它也能直接测序RNA。纳米孔单分子测序计算还有另一大特点，它能够直接读取出甲基化的胞嘧啶，而不必像传统方法那样对基因组进行bisulfite处理。这对于在基因组水平直接研究表观遗传相关现象有极大的帮助。并且改方法的测序准确性可达99.8%，而且一旦发现测序错误也能较容易地进行纠正。但目前似乎还没有应用该技术的相关报道。

Nanopore

参考：

1. 三代基因组测序技术原理简介
2. HiFi reads，基因组组装新趋势