噬菌体分离培养方法

噬菌体（bacteriophage, phage）是感染细菌、真菌、藻类 、放线菌或螺旋体等微生物的病毒的总称，因部分能引起宿主菌的裂解，故称为噬菌体。在葡萄球菌和志贺菌中首先发现。作为病毒的一种，噬菌体具有病毒的一些特性：个体微小，结构简单，只含一种核酸（DNA 或 RNA），必须在活细胞内寄生并以复制方式增殖。一旦离开了宿主细胞，噬菌体既不能生长，也不能复制。

依据核酸类型、形态结构、基本特征等对噬菌体进行了系统的分类。

（1）根据噬菌体的核酸类型，可分为双链DNA 噬菌体（即 dsDNA 噬菌体），单链 DNA 噬菌体（ssDNA 病毒），双链RNA （ssRNA）噬菌体和单链RNA（ssDNA）噬菌体。

（2）基于 Ackermann 和 Eisenstark 的形态分类法，噬菌体可分为有尾噬菌体目和无尾噬菌体目。据统计，目前观察到的大多数噬菌体是有尾的，分别属于长尾噬菌体科（Siphoviridae），肌尾噬菌体科（Myoviridae）和短尾噬菌体科（Podoviridae）。

（3）根据与宿主菌的相互关系，噬菌体还可分成毒性噬菌体和温和噬菌体。前者能在宿主菌细胞内复制增殖，产生许多子代噬菌体并最终裂解细菌；后者不能产生子代噬菌体，但噬菌体基因与宿主染色体整合，噬菌体随宿主进行 DNA 复制并随宿主的分裂而传代。

噬菌体是生命科学研究中不可或缺的理想材料和重要工具。近年来，随着抗生素的广泛使用，致病菌对大多数抗生素产生抗性，细菌耐药性的出现使抗生素的效果越来越不明显。噬菌体作为新的抗菌制剂在细菌性感染的治疗方面具有抗生素无法比拟的优势，可以显著高效地提高细菌感染动物的存活率，采用多价噬菌体和人工改造噬菌体治疗细菌感染性疾病的设想再次成为研究热点并不断完善。

噬菌体作为抗生素替代品在防治细菌性疾病方面的研究得到广泛关注。只有分离鉴定出噬菌体，才能对其物生物学特性、基因组结构等进行深入细致地分析和研究，才能更好地改造利用噬菌体。

1. 噬菌体的分离

噬菌体感染宿主细胞后，其DNA(或RNA)在细胞体内进行复制、转录，相关基因表达，装配成完整的噬菌体颗粒，最后裂解宿主细胞或通过挤出方式从宿主细胞中释放出来。因此，①在液体培养基中可使浑浊的菌悬液变为清亮或较清亮。利用噬菌体的这种特性，在样品中加入敏感菌株与液体培养基混合后培养，噬菌体便能大量增殖，释放，从而可分离到特定的噬菌体。

分离特定宿主噬菌体包括几个小步骤：首先分离培养出宿主细菌；再用无菌裂解液侵染宿主细菌；然后进行增殖培养；最后涂布检测看是否有噬菌体生长。

2. 噬菌体纯化

噬菌体纯化的标准为平板上生长的的噬菌斑形态一致。

噬菌斑是噬菌体感染敏感宿主细菌以后在含受体菌的涂布平板上形成的肉眼可见的透明圈。

将适量的噬菌体和敏感细菌在软琼脂中混合，然后平铺于琼脂培养基上，凝固后保温放置，在培养基平面上的细菌，由于噬菌体的作用被溶菌而形成圆形斑，称为噬菌斑。噬菌斑的大小，从肉眼勉强可见的小形斑直到直径1厘米以上的大形斑不等。一般溶原性噬菌体的噬菌斑中央残存着已溶原化的细胞，故成为混浊噬菌斑。相反，烈性噬菌体则形成透明噬菌斑。另还有透明与混浊部分相混杂的斑驳噬菌斑。在适当条件下，一个噬菌体粒子形成一个噬菌斑。

 

3. 噬菌体富集培养

为了获得足够多的噬菌体颗粒或者为了提取足够量的噬菌体DNA，需要对噬菌体进行富集培养。

常用液体培养法，培养12~18个小时，获得

此外，还有很多人关注多价噬菌体的筛选，其筛选分离纯化方法如下：

 

 

微基生物提供的噬菌体分离培养研究服务

实验流程如下：

 

参考文献：

Standardized bacteriophage purification for personalized phage therapy[J]. Nature Protocols, 2020, 15(9).

Yu P, Mathieu J, Li M, et al. Isolation of Polyvalent Bacteriophages by Sequential Multiple-Host Approaches.  2013.