第三代测序的介绍

第三代测序技术是指单分子实时测序技术,也叫从头测序技术。与前两代测序技术相比,其最大的特点就是单分子测序,测序过程无需进行PCR扩增,实现了对每一条DNA分子的单独测序。就当前形势来看,第二代短读长测序技术在测序市场上仍然占有绝对优势,但第三代测序技术近年来也发展的如火如荼,且已应用于基因组测序、甲基化研究和突变鉴定等多个研究领域。

目前主要的第三代测序技术根据测序原理的不同可分成:

1. 纳米孔电信号测序:牛津纳米孔公司(Oxford Nanopore Technologies,ONT)的纳米孔单分子测序(Single-molecule nanopore DNA sequencing)技术;

2. 单分子荧光信号测序:① 美国太平洋公司(Pacific Biosciences,PacBio)的单分子实时测序(Single molecule realtime,SMRT)技术;② Helicos Biosciences公司的单分子测序(True single molecular sequencing,tSMS)技术。

一、Nanopore测序

纳米孔测序,顾名思义,核心就是利用一个纳米孔,孔内共价结合有分子接头,将纳米孔蛋白固定在电阻膜上后,再利用动力蛋白牵引核酸穿过纳米孔。当核酸通过纳米孔时使电荷发生变化,从而引起电阻膜上电流的变化。由于纳米孔的直径非常细小,仅允许单个核酸聚合物通过,而ATCG单个碱基的带电性质不一样,因此不同碱基通过蛋白纳米孔时对电流产生的干扰不同,通过实时监测并解码这些电流信号便可确定碱基序列,从而实现测序。

测序过程

  1. 基因组片段化:首先对基因组DNA进行片段化,打断这个步骤是可选的,当起始的DNA量不足时可以对DNA进行打断,能够提高DNA分子的数量,达到提高数据产出的目的。
  2. DNA修复:分为FFPE修复和末端修复。FFPE修复识别无碱基位点并切割DNA骨架,用正确的碱基补平缺失的碱基。FFPE修复的酶是Bst DNA聚合酶,它能够补齐5’突出端,但不会切除3’突出末端。末端修复是把粘性末端修复为平末端,3’端加A,以便进行后面的连接反应。
  3. 接头连接:T4 DNA连接酶,通过TA连接的方法加上由ONT提供的测序接头。
  4. 上机测序

特点:

  1. 长读长:Reads可达Mb;
  2. 设备成本低:测序芯片可清洗再生,重复利用;
  3. 实时获得序列信息:最快可在1小时内完成测序流程及数据分析,满足动态检测宏基因组需求;
  4. 便携式测序装置:重量轻且占用空间小,可以随身携带随时测序;
  5. 直接测序:直接测序原始DNA和RNA,不需要进行PCR扩增,避免了扩增偏好性;保留了原始碱基修饰信息,能够直接读出甲基化的胞嘧啶。

二、Pacbio测序

SMRT测序采用四色荧光标记的dNTP和ZMW孔完成了对单个DNA分子的测序。每个ZMW孔中,单个DNA分子模板与引物结合,然后结合DNA聚合酶后,被固定到ZMW孔底部。加入四色荧光标记的dNTP,DNA合成开始,连接上的dNTP会由于碱基配对在ZMW底部停留较长时间,激发后发出对应的荧光信号被识别,返回的荧光信号会形成一个特殊的脉冲波。另一方面由于荧光信号连接在dNTP的磷酸基团上,当上一个dNTP合成后,磷酸基团自动脱落,保证了检测的连续性,提高了检测速度,每秒钟合成3个碱基的速度,配上高分辨率的光学检测系统,实现了实时检测。

1、Pacbio测序流程

 

1.1、样本质检

在整个建库及测序过程中,不需要对样品DNA进行PCR的扩增,实现了对每一条单分子DNA的测序,所以测序结果的好坏在很大程度上取决于样品的质量,因此,对样品DNA质量的检测显得尤为重要。主要包括以下两方面的检测:

  1. 浓度检测:以Qubit检测的DNA浓度为标准(包括后续的整个建库过程), Nanodrop辅助检测(要求OD260/280在1.8-2.0之间)。若Nanodrop测的值大于Qubit值的两倍,表明样品所含杂质较高,在建库之前需要对样品进行纯化;假如两者测的值相差不大,一般可直接进行打断建库。
  2. 电泳检测:进行1%的琼脂糖凝胶电泳检测样品DNA的完整性。

1.2、建库

第三代测序的介绍_第1张图片

 

1.3、BluePippin片段筛选

PacBio测序的一个最大优点是具有超长的读长,文库片段的大小直接影响着测序结果的平均长度,因此,为了提高测序质量,获得更长的平均插入片段,需要对文库进行BluePippin (BP)片段选择,以去除短片段的文库分子。

1.4、上机测序

通过BluePippin筛选后的文库,在库检及格后,根据片段大小,利用diffusion和magbead两种loading方式进行测序。

第三代测序的介绍_第2张图片

 

2、测序优势:

  1. 超长测序读长
  2. 超高的准确性
  3. 均一覆盖度:PacBio测序过程完全模拟了生物体内DNA的合成过程,无扩增和任何偏好性。随着GC含量的变化,每个碱基的覆盖率都基本保持一致。大大解决了二代测序中GC区难以跨越的问题,促进了高GC含量物种的测序研究。
  4. 直接检测表观修饰:PacBio测序另外一大亮点就是,在测序的同时能够直接检测碱基修饰。碱基合成过程中,四色标记的dNTP释放特定的荧光信号,并对应特定的脉冲信号。当碱基带有特定修饰时,相邻两个碱基的脉冲信号就会出现一个对应的时间间隔(Interpulse Duration,IPD),根据IPD值就可以判定出碱基修饰类型。

3、靶基因基因测序

还可以利用单分子实时测序(SMRT Cell)的方法对 marker 基因进行测序(比如16S全长测序),之后通过对 CCS(Circular Consensus Sequencing)序列过滤,得到 Optimization-CCS 进行 OTUs(Operational Taxonomic Units)聚类,并进行物种注释及丰度分析,可以揭示样品的物种构成;进一步进行α多样性分析(Alpha Diversity)、β多样性分析(Beta Diversity)和显著物种差异分析等等,可以挖掘样品之间的差异。

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