第三代测序的介绍

第三代测序技术是指单分子实时测序技术，也叫从头测序技术。与前两代测序技术相比，其最大的特点就是单分子测序，测序过程无需进行PCR扩增，实现了对每一条DNA分子的单独测序。就当前形势来看，第二代短读长测序技术在测序市场上仍然占有绝对优势，但第三代测序技术近年来也发展的如火如荼，且已应用于基因组测序、甲基化研究和突变鉴定等多个研究领域。

目前主要的第三代测序技术根据测序原理的不同可分成：

1. 纳米孔电信号测序：牛津纳米孔公司(Oxford Nanopore Technologies,ONT)的纳米孔单分子测序(Single-molecule nanopore DNA sequencing)技术；

2. 单分子荧光信号测序：① 美国太平洋公司(Pacific Biosciences,PacBio)的单分子实时测序(Single molecule realtime,SMRT)技术；② Helicos Biosciences公司的单分子测序(True single molecular sequencing,tSMS)技术。

一、Nanopore测序

纳米孔测序，顾名思义，核心就是利用一个纳米孔，孔内共价结合有分子接头，将纳米孔蛋白固定在电阻膜上后，再利用动力蛋白牵引核酸穿过纳米孔。当核酸通过纳米孔时使电荷发生变化，从而引起电阻膜上电流的变化。由于纳米孔的直径非常细小，仅允许单个核酸聚合物通过，而ATCG单个碱基的带电性质不一样，因此不同碱基通过蛋白纳米孔时对电流产生的干扰不同，通过实时监测并解码这些电流信号便可确定碱基序列，从而实现测序。

测序过程：

1. 基因组片段化：首先对基因组DNA进行片段化，打断这个步骤是可选的，当起始的DNA量不足时可以对DNA进行打断，能够提高DNA分子的数量，达到提高数据产出的目的。
2. DNA修复：分为FFPE修复和末端修复。FFPE修复识别无碱基位点并切割DNA骨架，用正确的碱基补平缺失的碱基。FFPE修复的酶是Bst DNA聚合酶，它能够补齐5’突出端，但不会切除3’突出末端。末端修复是把粘性末端修复为平末端，3’端加A，以便进行后面的连接反应。
3. 接头连接：T4 DNA连接酶，通过TA连接的方法加上由ONT提供的测序接头。
4. 上机测序

特点：

1. 长读长：Reads可达Mb；
2. 设备成本低：测序芯片可清洗再生，重复利用；
3. 实时获得序列信息：最快可在1小时内完成测序流程及数据分析，满足动态检测宏基因组需求；
4. 便携式测序装置：重量轻且占用空间小，可以随身携带随时测序；
5. 直接测序：直接测序原始DNA和RNA，不需要进行PCR扩增，避免了扩增偏好性；保留了原始碱基修饰信息，能够直接读出甲基化的胞嘧啶。

二、Pacbio测序

SMRT测序采用四色荧光标记的dNTP和ZMW孔完成了对单个DNA分子的测序。每个ZMW孔中，单个DNA分子模板与引物结合，然后结合DNA聚合酶后，被固定到ZMW孔底部。加入四色荧光标记的dNTP，DNA合成开始，连接上的dNTP会由于碱基配对在ZMW底部停留较长时间，激发后发出对应的荧光信号被识别，返回的荧光信号会形成一个特殊的脉冲波。另一方面由于荧光信号连接在dNTP的磷酸基团上，当上一个dNTP合成后，磷酸基团自动脱落，保证了检测的连续性，提高了检测速度，每秒钟合成3个碱基的速度，配上高分辨率的光学检测系统，实现了实时检测。

1、Pacbio测序流程

 

1．1、样本质检

在整个建库及测序过程中，不需要对样品DNA进行PCR的扩增，实现了对每一条单分子DNA的测序，所以测序结果的好坏在很大程度上取决于样品的质量，因此，对样品DNA质量的检测显得尤为重要。主要包括以下两方面的检测:

1. 浓度检测：以Qubit检测的DNA浓度为标准（包括后续的整个建库过程）， Nanodrop辅助检测（要求OD260/280在1.8-2.0之间）。若Nanodrop测的值大于Qubit值的两倍，表明样品所含杂质较高，在建库之前需要对样品进行纯化；假如两者测的值相差不大，一般可直接进行打断建库。
2. 电泳检测：进行1%的琼脂糖凝胶电泳检测样品DNA的完整性。

1.2、建库

 

1.3、BluePippin片段筛选

PacBio测序的一个最大优点是具有超长的读长，文库片段的大小直接影响着测序结果的平均长度，因此，为了提高测序质量，获得更长的平均插入片段，需要对文库进行BluePippin （BP）片段选择，以去除短片段的文库分子。

1.4、上机测序

通过BluePippin筛选后的文库，在库检及格后，根据片段大小，利用diffusion和magbead两种loading方式进行测序。

 

2、测序优势：

1. 超长测序读长
2. 超高的准确性
3. 均一覆盖度：PacBio测序过程完全模拟了生物体内DNA的合成过程，无扩增和任何偏好性。随着GC含量的变化，每个碱基的覆盖率都基本保持一致。大大解决了二代测序中GC区难以跨越的问题，促进了高GC含量物种的测序研究。
4. 直接检测表观修饰：PacBio测序另外一大亮点就是，在测序的同时能够直接检测碱基修饰。碱基合成过程中，四色标记的dNTP释放特定的荧光信号，并对应特定的脉冲信号。当碱基带有特定修饰时，相邻两个碱基的脉冲信号就会出现一个对应的时间间隔（Interpulse Duration，IPD），根据IPD值就可以判定出碱基修饰类型。

3、靶基因基因测序

还可以利用单分子实时测序（SMRT Cell）的方法对 marker 基因进行测序（比如16S全长测序），之后通过对 CCS（Circular Consensus Sequencing）序列过滤，得到 Optimization-CCS 进行 OTUs（Operational Taxonomic Units）聚类，并进行物种注释及丰度分析，可以揭示样品的物种构成；进一步进行α多样性分析（Alpha Diversity）、β多样性分析（Beta Diversity）和显著物种差异分析等等，可以挖掘样品之间的差异。