单细胞测序分析上游cellranger软件入门介绍

公共数据库中的SRA 单细胞转录组数据究竟包含了哪些数据？CellRanger怎样利用10x平台下机数据进行下游一系列分析？这篇文章简单记录CellRanger 包括的主要分析步骤，纯理论。

SRA 原始数据转fastq

公共数据库的SRA 数据需要借助fastq-dump 转为fastq文件，然后进行质控、CellRanger定量等操作。相较于普通转录组数据，原始SRA数据会得到3个fastq文件，分别是Library 的Index(8bp)文件，包括长度为26bp 的Barcode（16bp）和UMI(10bp)的Read1文件，和测序reads文件。

conda install -c bioconda sra-tools ## 安装软件
wkd=/home/project/single-cell/MCC
cd $wkd/raw/P2586-4
cat SRR_Acc_List-2586-4.txt |while read i
do
time fastq-dump --gzip --split-files -A $i ${i}.sra && echo "** ${i}.sra to fastq done **"
done
### 单细胞数据参数为 --split-files 而不是 --split-3

image

i7 sample index (library barcode）
是加到Illumina测序接头上的，保证多个测序文库可以在同一个flow-cell上或者同一个lane上进行混合测序(multiplexed)。它的作用就是在CellRanger的mkfastq 功能中体现出来的，它自动识别样本index名称（例如：SA-GA-A1），将具有相同4种oligo的fq文件组合在一起，表示同一个样本。它保证了一个测序lane上可以容纳多个样本

Barcode
是10X特有的，用来区分GEMs，也就是对细胞做了一个标记。一般在拆分混样测序数据（demultiplexing）这个过程后进行操作，当然这也很符合原文的操作。

UMI
UMI就是Unique Molecular Identifier，由4-10个随机核苷酸组成，在mRNA反转录后，进入到文库中，每一个mRNA随机连上一个UMI，根据PCR结果可以计数不同的UMI，最终统计mRNA的数量。它的主要作用是，处理PCR 扩增偏差，因为起始文库很小时需要的PCR扩增次数就越多，因为越容易引入扩增误差。

fastq文件更名
为什么要更名？CellRanger 定量过程输入文件指定命名格式。
如何更名？下图格式：

image

# 比如，将原来的SRR7692286_1.fastq.gz改成SRR7692286_S1_L001_I1_001.fastq.gz
# 依次类推，将原来_2的改成R1，将_3改成R2
cat  SRR_Acc_List-9245-3.txt | while read i ;do (mv ${i}_1*.gz ${i}_S1_L001_I1_001.fastq.gz;mv ${i}_2*.gz ${i}_S1_L001_R1_001.fastq.gz;mv ${i}_3*.gz ${i}_S1_L001_R2_001.fastq.gz);done

fastq 文件质控
主要查看Q30比例。

# 以P2586-4为例
mkdir -p $wkd/qc
cd $wkd/qc
find $wkd/raw/P2586-4 -name '*R1*.gz'>P2586-4-id-1.txt
find $wkd/raw/P2586-4 -name '*R2*.gz'>P2586-4-id-2.txt
cat P2586-4-id-1.txt P2586-4-id-2.txt >P2586-4-id-all.txt

cat P2586-4-id-all.txt| xargs fastqc -t 20 -o ./

CellRanger 流程

它主要包括四个主要基因表达分析流程：

cellranger mkfastq ：它借鉴了Illumina的bcl2fastq ，可以将一个或多个lane中的混样测序样本按照index标签生成样本对应的fastq文件。即对下机数据base calling files转为fastq文件。
cellranger count ：利用mkfastq生成的fq文件，进行比对(基于STAR)、过滤、UMI计数。利用细胞的barcode生成gene-barcode矩阵，然后进行样本分群、基因表达分析
cellranger aggr ：接受cellranger count的输出数据，将同一组的不同测序样本的表达矩阵整合在一起，比如tumor组原来有4个样本，PBMC组有两个样本，现在可以使用aggr生成最后的tumor和PBMC两个矩阵，并且进行标准化去掉测序深度的影响
cellranger reanalyze ：接受cellranger count或cellranger aggr生成的gene-barcode矩阵，使用不同的参数进行降维、聚类。属于定制化分析。

它的结果主要是包含有细胞信息的BAM, MEX, CSV, HDF5 and HTML文件

CellRanger 软件安装及测试实战操作参考：CellRanger走起(四) CellRanger流程概览。包括安装详细指南及其他一些小技巧。

拆分数据 mkfastq、细胞定量 count、定量组合 aggr

mkfastq 拆分
目的：将每个flowcell 的Illumina sequencer's base call files (BCLs)转为fastq文件

特色：它借鉴了Illumina出品的bcl2fastq，另外增加了：

将10X 样本index名称与四种寡核苷酸对应起来，比如A1孔是样本SI-GA-A1，然后对应的寡核苷酸是GGTTTACT, CTAAACGG, TCGGCGTC, and AACCGTAA ，那么程序就会去index文件中将存在这四种寡核苷酸的fastq组合到A1这个样本
提供质控结果，包括barcode 质量、总体测序质量如Q30、R1和R2的Q30碱基占比、测序reads数等
可以使用10X简化版的样本信息表

### 两种使用方式
# 第一种
$ cellranger mkfastq --id=bcl \
                     --run=/path/to/bcl \
                     --samplesheet=samplesheet-1.2.0.csv
# 第二种
$ cellranger mkfastq --id=bcl \
                     --run=/path/to/bcl \
                     --csv=simple-1.2.0.csv
# 其中id指定输出目录的名称，run指的是下机的原始BCL文件目录
# 重要的就是测序lane、样本名称、index等信息

参考文章CellRanger走起(四) CellRanger流程概览中解释了几种不同方式输出fastq文件的不同存放目录，可根据实际分析自行查找。

count 定量
这个过程是最重要的，它完成细胞与基因的定量，它将比对、质控、定量都包装了起来，内部流程很多，但使用很简单。每个版本要求的参数是不同的，尤其是V2与V3版本存在较大差异，这里先对V2进行了解。

# 这是示例，不是真实数据 #
cellranger count --id=sample345 \
                   --transcriptome=/opt/refdata-cellranger-GRCh38-1.2.0 \
                   --fastqs=/home/scRNA/runs/HAWT7ADXX/outs/fastq_path \
                   --sample=mysample \
                   --expect-cells=1000 \
                   --nosecondary
# id指定输出文件存放目录名
# transcriptome指定与CellRanger兼容的参考基因组
# fastqs指定mkfastq或者自定义的测序文件
# sample要和fastq文件的前缀中的sample保持一致，作为软件识别的标志
# expect-cells指定复现的细胞数量，这个要和实验设计结合起来
# nosecondary 只获得表达矩阵，不进行后续的降维、聚类和可视化分析(因为后期会自行用R包去做)

###输出文件
Outputs:
- Run summary HTML:                      /opt/sample345/outs/web_summary.html
- Run summary CSV:                       /opt/sample345/outs/metrics_summary.csv
- BAM:                                   /opt/sample345/outs/possorted_genome_bam.bam
- BAM index:                             /opt/sample345/outs/possorted_genome_bam.bam.bai
- Filtered gene-barcode matrices MEX:    /opt/sample345/outs/filtered_gene_bc_matrices
- Filtered gene-barcode matrices HDF5:   /opt/sample345/outs/filtered_gene_bc_matrices_h5.h5
- Unfiltered gene-barcode matrices MEX:  /opt/sample345/outs/raw_gene_bc_matrices
- Unfiltered gene-barcode matrices HDF5: /opt/sample345/outs/raw_gene_bc_matrices_h5.h5
- Secondary analysis output CSV:         /opt/sample345/outs/analysis
- Per-molecule read information:         /opt/sample345/outs/molecule_info.h5
- Loupe Cell Browser file:               /opt/sample345/outs/cloupe.cloupe

Pipestance completed successfully!

输出文件从上到下依次来看：

web_summary.html：官方说明 summary HTML file
metrics_summary.csv：CSV格式数据摘要
possorted_genome_bam.bam：比对文件
possorted_genome_bam.bam.bai：索引文件
filtered_gene_bc_matrices：是重要的一个目录，下面又包含了 barcodes.tsv.gz、features.tsv.gz、matrix.mtx.gz，是下游Seurat、Scater、Monocle等分析的输入文件
filtered_feature_bc_matrix.h5：过滤掉的barcode信息HDF5 format
raw_feature_bc_matrix：原始barcode信息
raw_feature_bc_matrix.h5：原始barcode信息HDF5 format
analysis：数据分析目录，下面又包含聚类clustering（有graph-based & k-means）、差异分析diffexp、主成分线性降维分析pca、非线性降维tsne
molecule_info.h5：下面进行aggregate使用的文件
cloupe.cloupe：官方可视化工具Loupe Cell Browser 输入文件

count 定量的重点和难点在于参考基因组索引的构建，可详细参考CellRanger走起(四) CellRanger流程概览，文章中还介绍了怎样自行构建参考基因组索引，及一比对过程的重要细节信息。

aggr
当处理多个生物学样本或者一个样本存在多个重复/文库时，最好的操作就是先分别对每个文库进行单独的count定量，然后将定量结果利用aggr组合起来.

得到count结果
构建Aggregation CSV
运行aggr

### step1
$ cellranger count --id=LV123 ...
... wait for pipeline to finish ...
$ cellranger count --id=LB456 ...
... wait for pipeline to finish ...
$ cellranger count --id=LP789 ...
... wait for pipeline to finish ...

## step2
# AGG123_libraries.csv
library_id,molecule_h5
LV123,/opt/runs/LV123/outs/molecule_info.h5
LB456,/opt/runs/LB456/outs/molecule_info.h5
LP789,/opt/runs/LP789/outs/molecule_info.h5
# 其中
# molecule_h5：文件molecule_info.h5 file的路径 

### step3
cellranger aggr --id=AGG123 \
                  --csv=AGG123_libraries.csv \
                  --normalize=mapped
# 结果输出到AGG123这个目录中

cellranger count的结果

count结果一般放在out目录下，主要有summary和analysis两大类

Summary
是一个HTML格式文件，包括实验捕获的细胞数目、检测到的基因数目、测序数据的产出与质量统计、参考基因组的比对情况。

image

几个指标可以关注一下：

左上部分中，包括了reads数、barcodes数、UMI、index、Q30等统计值
左下是reads比对的比例，包括基因间区、外显子、内含子，如果比对率太低(一般认为外显子的比对率要在60%以上)
右上图是利用barcodes上的UMI标签分布来估计细胞数，绿/蓝色表示细胞，灰色表示背景，其中Y轴表示每个barcode对应的UMI数量，X轴是一定数量的UMI序列所对应barcode的数量，比如上图中有1000个barcodes含有10k个UMI，细胞过滤就是通过这个图来展示的。
首先明确，barcode用来区分细胞，UMI用来区分转录本；其次，barcodes数量时要大于细胞数量的（以保证每个细胞都会有barcode来进行区分）如果图线陡降说明

另参考文章CellRanger走起(二) CellRanger out 结果中还记录了一个手动构建物种GTF文件的案例尝试，及相应的检验方法，可以根据需要自行学习。

总之，无论是从公共数据库下载单细胞SRA数据，还是来自10x 平台的原始下机数据，或者先经过fastq-dump转为fastq文件，然后质控，然后CellRanger count 定量，或者首先自行拆分数据mkfastq，然后构建索引进行细胞定量，及可选的定量组合等。CellRanger的总体流程见本文记录，但是其中的各个细节仍需要自行实践总结。

作者：新欣enjoy
链接：https://www.jianshu.com/p/5157ab9f6977

单细胞测序分析上游cellranger软件入门介绍

SRA 原始数据转fastq

CellRanger 流程

拆分数据 mkfastq、细胞定量 count、定量组合 aggr

cellranger count的结果

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