首次揭示 SLC22A12 可能是抑制 ccRCC 进展的诊断和预后生物标志物

Low Expression Levels of SLC22A12 Indicates a Poor Prognosis and Progresses Clear Cell Renal Cell Carcinoma

SLC22A12的低表达水平表明预后不佳，进展为透明细胞肾细胞癌

发表期刊：Front Oncol

发表日期：2021 Jun 23

影响因子：5.738

DOI:  10.3389/fonc.2021.659208

一、背景

        肾癌，在肺部或脑部可发生致命的转移，因此对人类健康构成了重大威胁。肾癌主要包括肾细胞癌（RCC）、过渡细胞癌（TCC）和肾母细胞瘤。RCC大约占肾癌的4/5，而其他肾癌大多是TCC。

        维持平衡对一个健康的身体来说是至关重要的，同样的情况也发生在组成细胞中。发生复杂的细胞内反应以维持各种生物大分子的水平，包括多种酶，转运蛋白，激酶和细胞因子。上皮细胞生存的环境比正常细胞更复杂。由于存在物质的活跃交换，代谢废物的大量积累以及独特的渗透压差，因此维持细胞稳态更具挑战性。在适应这种恶劣环境的过程中，上皮细胞已经开发出一种克隆策略来取代去角质的细胞。该策略有助于导致异位失调、肿瘤发生和蛋白表达谱差异。

        研究发现溶质载体家族22成员12（SLC22A12）是一个组织特异性基因，在肾癌的发生和发展中起着重要作用。SLC22A12也被称为尿酸盐转运体1（URAT1）或肾脏特异性转运体（RST），是一种位于肾脏近端小管上皮细胞中的膜蛋白。

二、材料与方法

1.数据来源

1） 数据收集自TCGA、cBioPortal for Cancer Genomics、UCSC Xen和ICGC，包括肾脏肾透明细胞癌（KIRC）患者的基因表达数据集及临床信息。

2） ccRCC组织样本：120对ccRCC及其相邻的正常肾脏组织；从16对中提取的蛋白质通过免疫印迹试验进行分析；从20对样本中提取的RNA通过qRT-PCR进行分析；两对组织通过IHC进行分析；三对组织通过全转录组测序进行分析

3） 细胞培养：人肾近端肾小管上皮细胞系HK-2，以及从ATCC购买的五种人肾细胞癌细胞系，包括786-O、ACHN、A-498、OSRC-2和Caki-1

2.实验流程

1） 筛选涉及ccRCC细胞稳态的关键基因：细胞平衡的基因集从GO下载；肾脏特异性基因组从人类蛋白质图谱中收集；差异表达基因集由 "limma "软件包获得；SLC22A12的泛癌谱是由GEPIA收集

2） 免疫印迹试验（IBT）、RNA提取和qRT-PCR、免疫组织化学（IHC）检测

3） 细胞实验：瞬时转染过度表达和敲除SLC22A12、菌落形成试验、5-乙炔基-2′-脱氧尿苷（EdU）试验、细胞计数试剂盒-8（CCK8）试验、细胞迁移和侵袭试验

4） 生物信息学分析：SLC22A12表达的中位数被设定为将患者分为高表达和低表达组的分界点；GSEA

三、实验结果

01 - SLC22A12是一个重要的肾脏特异性肿瘤抑制基因，维持细胞稳态

        这项工作的目的之一是确定ccRCC的细胞平衡的关键基因，作者筛选了三个独立的基因组。TCGA数据集中的DEGs，肾脏特异性基因集，以及细胞稳态基因集，结果发现只有19个基因属于这三个基因集（图1A）。接下来，进行了单变量的Cox回归分析，以探索基因表达水平与患者生存率之间的关系。如图1B、C所示，在所有19个基因中，只有SLC22A12、PTH1R、MT1G和SLC34A1的表达对总生存率（OS）和无病生存率（DFS）有明显影响。多变量Cox分析（图1D-K）和临床病理数据证实，SLC22A12是OS和DFS的独立风险因素，具有更好的预后价值。除了两个肉瘤样本（SARC），没有其他癌症转录组资料包括SLC22A12（图2A，B）。除此之外，SLC22A12只在肾脏中表达（KIRC：肾脏透明细胞癌；KIRP：肾脏乳头状细胞癌；KICH：肾脏染色体）。从上述结果来看，SLC22A12被选为进一步研究的主要基因。

图1 筛选出参与ccRCC细胞平衡的关键基因

02 - SLC22A12下调与ccRCC的各种类型的临床病理特征有关

        从TCGA数据库中下载了ccRCC组织和癌旁组织中SLC22A12 mRNA表达水平的数据，以了解SLC22A12表达在肿瘤发生中的作用。结果表明，SLC22A12在肿瘤组织中的表达明显低于癌旁组织（图2C，D），在ICGC数据库中也发现了类似的结果。此外，作者研究了SLC22A12表达与临床病理特征之间的联系，发现该基因表达的降低与原发肿瘤（T期）、区域淋巴结（N期）、远处转移（M期）、组织学分级（G期）和AJCC预后阶段的增加有关（图2F-M）。另外，女性的SLC22A12表达量较低（图2E）。

图2 TCGA数据库中肾癌SLC22A12的转录组概况

        应用K-M生存分析和对数秩检验来确定患者的生存与SLC22A12表达之间的关系。从TCGA数据库中，以SLC22A12 mRNA表达中位数为分界标准，将522名ccRCC患者分为两组。结果发现，SLC22A12表达量较低的一组，其OS和DFS最差（图3A，B），ICGC-RECA队列的生存数据显示了类似的结果模式。关于SLC22A12在具有不同临床病理特征的ccRCC患者中表达的K-M生存分析与之前的结果一致（图3C-Q）。结果表明，SLC22A12在ccRCC中可能有预后价值，因为它的表达减少会导致患者的预后不佳。

图3 SLC22A12 mRNA的低表达与ccRCC患者的不良OS和DFS有关

        为了探索SLC22A12在ccRCC中的诊断价值，作者绘制了ROC曲线来评估患者的临床病理特征。一般来说，利用SLC22A12的表达水平可以将ccRCC与正常组织适当区分开来，TCGA-KIRC队列的AUC为0.7258（图4A），ICGC-RECA队列为0.8926。此外，SLC22A12表达水平的诊断价值在临床病理亚组之间进行了分析：男性对女性（图4B）；T1+T2对T3+T4阶段（图4C）；N0对 N1期（图4D）；M0期与M1期（图4E）；AJCC I+II期与III+IV期（图4F）；G1+G2与G3+G4（图4G）。结论是，SLC22A12可能是透明细胞肾细胞癌的潜在诊断生物标志物。

图4 SLC22A12的表达可能是ccRCC患者的一个诊断预测因素

03 - SLC22A12在ccRCC细胞和组织中下调

        作者进行了qRT-PCR和IBT来验证SLC22A12在RCC细胞中的表达水平。与正常细胞系HK-2相比，SLC22A12在RCC细胞系（786-O、ACHN、A-498、OSRC-2和Caki-1）中的mRNA和蛋白表达水平下降（图5D，E）。相比之下，SLC22A12在ccRCC组织中的表达水平明显高于其相应的邻近正常组织（图5A-C）。RNA-Seq队列也表明SLC22A12在肿瘤组织中下调（图5F）。此外，来自癌症/副癌症的IHC结果表明（图5G），SLC22A12主要位于癌症和正常肾小管上皮细胞的质膜上；然而，它在癌症细胞中被下调。一般来说，这些结果共同表明，SLC22A12在肾癌细胞中表达不足。

图5 与相应的对照组相比，SLC22A12在RCC细胞和组织中呈下调趋势

04 - SLC22A12限制了体外RCC细胞的增殖、侵袭和迁移

        用SLC22A12质粒或si-SLC22A12转染RCC细胞系，研究SLC22A12对肾癌病理的功能。与相应的阴性对照相比，ACHN和786-O细胞的mRNA和蛋白表达水平明显增加或减少（图6A-C）。在这两个细胞系中，通过菌落形成（图6D）、EdU（图6E，F）和CCK-8检测（图6G）分析了细胞活力，作者观察到SLC22A12沉默促进了细胞增殖。此外，转孔实验验证了SLC22A12的表达水平与细胞的迁移和侵入能力呈负相关（图6H）。总之，这些结果提供了坚实的证据，表明SLC22A12抑制了RCC细胞的增殖、迁移和侵袭，而这些在肿瘤转移中起着至关重要的作用。

图6 SLC22A12在体外促进RCC细胞的增殖、迁移和侵袭

05 - SLC22A12参与了调节细胞平衡和ccRCC发病机制的多种生物途径

        利用TCGA-KIRC队列进行多种功能富集分析，研究SLC22A12在ccRCC发病机制中的作用。如图7A-C所示，激活的基因集与多个代谢途径（图7A）、细胞周期（图7B）和肿瘤相关的信号通路（图7C）有关。代谢途径的富集，包括甘油脂、脂肪酸、葡萄糖，氨基酸和衍生物，和类固醇，表明SLC22A12对代谢物运输的作用也可能部分调节代谢过程。肿瘤相关途径的富集，包括Akt途径，Wnt途径，p53途径，mTOR信号途径，MAPK途径，Hedgehog信号途径和ERKs途径，表明异常表达的SLC22A12可能激活各种癌症途径，促进ccRCC的发生或发展。通过IBT验证了SLC22A12下调细胞中PI3K和Akt途径的激活。GO和KEGG分析表明，SLC22A12参与了多种有机化合物、离子和激素的运输，以及细胞外结构的组织（图7D，E）。

图7 SLC22A12在ccRCC中的功能富集分析

        为了进一步研究SLC22A12如何影响细胞平衡，作者用String数据库进行了PPI网络分析，并选择了20个具有最高可信度的蛋白质。如图S3所示，大多数的蛋白质都与平衡状态的维持有关。例如，SLC2A5和SLC2A9参与葡萄糖和果糖运输；SLC38A3运输氨基酸，而SLC5A8和SLC16A9运输各种单羧酸盐。另外，许多对物质交换至关重要的离子泵也与SLC22A12有关。此外，大多数基因在肿瘤组织中的表达与正常组织不同，表明ccRCC的细胞平衡状况完全不同（图S4）。总之，SLC22A12可能与这些调节肿瘤细胞平衡的蛋白相互作用，从而影响细胞的增殖、侵袭和迁移。

图S3 与SLC22A12相关的基因的蛋白质-蛋白质相互作用网络

图S4  TCGA-KIRC 队列中基于 PPI 网络的 SLC22A12 相关基因的热图 

四、结论

        这是第一个证明SLC22A12的高表达水平与ccRCC患者的不良生存率和低临床病理分期有关的研究。此外，SLC22A12的高表达水平可能降低RCC细胞在体外的增殖、迁移和侵袭能力。上述结果表明，SLC22A12是一个重要的肾癌生物标志物，也是一个潜在的高度特异性治疗目标。SLC22A12的下调可能影响细胞的平衡，改变肿瘤细胞的生存。