分享 | ATAC-seq建库protocol

       哈喽大家好，前面小编和大家分享了ATAC-seq数据分析的流程，那么，ATAC-seq建库是否也可以DIY呢？下面就和大家分享一则ATAC-seq建库的protocol吧~(关注我们的公众号并在后台回复“ATACseq”可获取更多ATAC-seq实验protocol及数据分析代码)

材料试剂：

2ml glass tissue grinder and pestle (Kimble chase, 885301-0002, 885300-0002)

40 μm cell strainer (Fisher, 352340)

Illumina Tagment DNA buffer (Cat#: 15027866) (TD buffer)

Illumina Nextera Tagment DNA enzyme (Cat#: 15027916) (TDE)

NEBNext High-Fidelty 2xPCR Master Mix (NEB M0514S)

10,000 x SYBR Green I (Invitrogen Cat# -7563)

实验步骤：

1. 将冷冻的组织（5-10 mg）于干冰及液氮中研磨成粉末状；

2. 将粉碎的组织重悬于1 ml 1×PBS中，4℃，2000g离心3 min；

3. 去上清，于1 ml LB1中重悬；

4. 4℃摇床孵育10 min；

5. 将样品转移至2 ml 玻璃试管中，轻轻震荡15次，重新转移至1.5 ml Ep管中；

6. 4℃，2000g离心5 min；

7. 去上清，于1 ml 预冷PBS中重悬；

8. 过40 uM细胞筛网；

9. 取10^5个细胞核（台盼蓝染色计数）至新的1.5 mL Ep管中，每样重复3次，并用PBS将体积补齐至50ul；

10. 4℃，500g离心 10min；去上清；

11. 每管样品加入12.5 uL TD缓冲液，10 uL ddH2O以及2.5 uL TDE，转移至PCR管中；

12. PCR仪中37℃孵育1 h。

13. 采用Qiagen MiniElute分离转座酶处理的DNA（此时可于-20℃保存，或进行文库扩增）

14. 文库扩增

反应体系：

PCR程序：（为减少PCR过程中的GC及片段长度偏差，第一轮PCR设置5轮扩增）

15. qPCR预测PCR反应最适的循环数

反应体系：

qPCR程序：

16. 最适PCR循环数计算方法：

（1）绘制荧光强度与循环数的线性关系图；

（2）最大荧光减去最小荧光，得到荧光强度差；

（3）1/4荧光强度差加上最小荧光强度，得到下荧光；1/3荧光强度差加上最小荧光，得到上荧光；

（4）计算下荧光及下荧光对应的循环数。

17. 将剩余步骤9中的45 ul PCR产物放回PCR仪中继续反应：

PCR程序：

18. 用Qiagen MinElute PCR纯化试剂盒纯化扩增文库；使用20μl EB洗脱。

19. 凝胶分离和纯化：

将纯化后的PCR产物装在2%的EX凝胶上，不加染料，运行6分钟，标记凝胶，采用Qubit收集除60bp primer外的所有产物；胶回收，用EB缓冲液洗脱20ul。

20. 用Qubit测定DNA浓度。

21. 生物分析仪

采用生物分析仪检测样品，大小约150-1000bp之间，记录平均大小、浓度（pg/ul）和摩尔浓度（nmol/l）。用于与后续测序结果匹配（检查峰值形状是否与测序数据相关）。

怎么样，是不是很简单呢？快来试一试吧！