hello，大家好，又是周一，新的开始，今天我们要继续分享单细胞空间联合分析的内容，增进自己的理解，参考文章在Epithelial Plasticity and Innate Immune Activation Promote Lung Tissue Remodeling following Respiratory Viral Infection，利用单细胞空间技术来解析肺上皮细胞的可塑性，我们来看看具体如何运用的。
Summary
在干细胞遗传耗竭后的小鼠肺中已经提出上皮可塑性，但其生理相关性未知。病毒感染和慢性肺病具有相似的病理特征，如肺泡干细胞丢失、小气道基底细胞 (BC) 增生和先天免疫激活，这些都会导致上皮重塑和肺功能丧失。分析展示了一种新的远端气道分泌细胞谱系，即叶内浆液 (IS) 细胞，在流感病毒感染后被激活以承担 BC 的命运。新生 BC 通过 IL-22ra1 的高表达与预先存在的 BC 不同，并进行 IL-22 依赖性扩增以定植受伤的肺泡（这个地方就需要空间的分析技术）。病毒引起的炎症消退导致重新填充的肺泡中 BC>IS 重新分化，并增加了抗菌因子的局部表达，但未能取代正常的肺泡上皮。因此，上皮可塑性可以防止急性呼吸道病毒感染导致的死亡，但会导致远端肺重塑和肺功能丧失。
Introduction
干细胞可塑性有助于组织再生，并包括一系列过程，如特化祖细胞的谱系转换和去分化。尽管从谱系追踪和靶向细胞ablation研究中推断出肺修复中的上皮细胞可塑性，但肺疾病的生理相关性尚不清楚。The epithelial linings of airways and alveoli are maintained by distinct regional facultative stem/progenitor cells whose progeny include both self-renewing and differentiating subsets。分化后代命运的区域差异允许维持局部特化的上皮功能，例如传导气道中的粘液纤毛清除和宿主防御以及远端respiratory units中的气体交换。在稳态组织维持期间，将祖细胞及其分化后代限制在不同的解剖区，对于沿近远轴的这些compartments的功能整合和正常生理肺功能的保存是必要的。然而，急性肺损伤和慢性肺病会破坏正常的祖细胞compartmentalization，导致异常的组织重塑和肺功能下降。在感染甲型 H1N1 流感病毒或 SARS-CoV2 等呼吸道病毒以及慢性肺病如特发性肺纤维化 (IPF) 后就是这种情况。在这种情况下，气道中的 basal cell (BC) 增生导致这些细胞募集和定植到受伤的肺泡区域，并且远端肺组织的这种近端化可能导致肺泡扩散能力丧失，危及生命。然而，导致远端肺组织近端化的上皮祖细胞的身份以及在组织重塑过程中调节其命运的机制仍不清楚。
Mirroring what occurs in injured or injected human lungs, acute lung injury in mice infected with a mouse-adapted Puerto Rico 8 (PR8) variant of H1N1 influenza virus is accompanied by BC expansion in airways that ultimately replaces the injured epithelium of the alveolar gas-exchange region。尽管基底细胞和棒状细胞分别用作维持近端气道假复层上皮和远端气道立方上皮的干细胞，但谱系追踪研究表明，PR8 感染小鼠远端肺组织中出现的增生性 BC这些典型的干细胞群。相反，PR8 引发的 BC（在此称为新生 BC）源自替代的小气道祖细胞，这些祖细胞可以根据 Sox2 或 p63 转录因子的表达进行谱系追踪。类似地，在近端气道中，黏膜下腺 (SMG) 表达平滑肌肌动蛋白的肌上皮细胞或表达 SSEA4 的基底细胞分泌细胞后代可以在损伤后补充基底干细胞。然而，SMG 的上皮祖细胞或可替代局部基底干细胞的上呼吸道表面上皮细胞与 PR8 感染后在小气道中产生扩大的 BC 细胞之间的分子和功能关系仍有待确定。
尽管对regulate the renewal and fate of BC within pseudostratified airways的机制知之甚少，但对 PR8 感染小鼠肺泡上皮中出现的增生性 BC 的调节机制尚不清楚。局部缺氧和伴随 PR8 感染改变的炎症环境的作用的证据表明先天免疫激活作为 BC 命运和上皮重塑的调节剂的潜在作用。上皮免疫串扰是肺、肠道和皮肤等多个器官中祖细胞功能的关键调节剂。在这里，分析表明 PR8 感染引起的新生 BC 的独特起源和分子表型允许它们对激活的先天免疫系统产生动态反应。源自局部活化的γδT细胞的白细胞介素22促进肺泡上皮内BC的自我更新和增生，在PR8引起的炎症反应消退期间，这些细胞最终在先前受伤的区域呈现serous cell fates。这种对呼吸道病毒感染的重塑反应允许有效更换受损肺泡上皮中暴露的基底膜，并在局部产生抗菌分泌物以防止继发性细菌感染。
Results
Activation and expansion of intralobular serous (IS) cells precedes BC hyperplasia following influenza-induced acute lung injury
BC 增生发生在慢性肺病患者的气道和死于急性呼吸道病毒感染（如 H1N1 流感病毒或 COVID-19）的患者的肺组织中。根据谱系追踪研究，发现响应流感病毒诱导的急性肺损伤而获得 BC 命运的小鼠肺中的大多数细胞来自未成熟的 P63+Krt5-基础祖细胞。然而，在受伤期间看到的大部分新生 BC 未能保留 P63 谱系标签，表明存在其他有贡献的非基础祖细胞。分析试图通过评估上皮细胞群响应流感引起的急性肺损伤的动态变化来query非经典祖细胞的存在。为从对照 C57Bl/6 小鼠（第 0 天）的气管、肺外支气管、肺叶内气道和肺泡区域分离的上皮细胞以及感染 H1N1 流感病毒 PR8 株并从中恢复的小鼠生成了单细胞转录组的综合概况（第 3-240 天）。显示为统一流形近似和投影 (UMAP) 二维图的结果显示了八个主要细胞cluster，这些细胞cluster根据已知的肺上皮细胞类型根据其独特的基因表达特征进行分类。尽管在从所有对照和暴露后时间点采样的上皮细胞中都观察到了每种主要细胞类型，但它们在总采样上皮细胞中的相对比例显示出显著的变化。
BC 在从对照小鼠或 PR8 感染后 3-9 天的小鼠的lobes中取样的上皮细胞中很少见，但此后表现出逐渐增加。Serous cells是幼稚小鼠肺叶中唯一的其他罕见上皮细胞类型，其丰度在 PR8 感染后增加。然而，在整个时间过程中采样的上皮细胞中，representation of serous cells的增加先于 BC representation的增加。此外，与在幼稚小鼠气道中观察到的Serous cells相比，在暴露于 PR8 的肺中观察到的Serous cells包括在所有暴露后恢复时间点具有 BC 标记基因 Trp63、Krt14 和 Krt5 异位表达的一个subsets。有趣的是，在 PR8 感染后的恢复过程中观察到的Serous cells群在远端肺上皮细胞类型中是独一无二的，它们表达了参与抗微生物宿主防御的基因，例如 Ifitm1、Ifitm3、Bpifa1 和 Ltf。在从 PR8 暴露恢复期间，这种Serous cells群的扩展以及获得与新生气道 BC 具有相似性的转录组，使我们推测稀有气道Serous cells代表了在气道和肺泡上皮中观察到的新生 BC 的祖细胞来源受感染的老鼠。
因为serous cells 在 PR8 感染反应的早期阶段在单细胞数据集中表现出增加的epresentation，我们推测epresentation代表了新生 BC 的祖细胞类型。为了进一步探索在气道对 PR8 感染的反应早期出现的serous cells的分子表型，我们利用我们的单细胞数据集来识别候选差异表达基因 (DEG)，这些基因在传导气道中将浆液细胞与其他上皮细胞类型区分开来。尽管club and serous cells之间的基因表达特征有许多相似之处，但这些上皮细胞群的无监督聚类不受细胞周期基因表达的影响。我们发现serous cells表达高水平的 Scgb3a2，club细胞也是如此，但与俱club细胞不同的是，它们缺乏 Scgb1a1 的表达。Furthermore, antimicrobial factors, such as Bpifa1 and Ltf, whose expression defines serous cells of proximal airways and submucosal glands, were significantly elevated in serous cells compared to club cells of the PR8 injured lung。免疫荧光标记显示，一小部分小叶内 Scgb3a2 阳性细胞对 Msln 和 Bpifa1 也呈阳性，表明下呼吸道内存在serous cells 群，在此称为 intralobular serous (IS) 细胞。
- 注：Feature plot comparing expression of selected club and serous cell-specific genes between cell types。
Transcriptome analysis predicts IS>basal plasticity during recovery from PR8 infection.
为了进一步检查 IS 细胞作为原始 BC 扩增祖细胞的潜力，我们使用基因集富集来鉴定 PR8 感染后不同时间这些上皮细胞cluster中的 DEG（富集分析说的这么清新脱俗）。 在感染后 5 天和 7 天观察到与细胞周期相关的基因组的显著诱导，同时在体内观察到增殖的conducting airway epithelium的出现。 然而，在这些时间点仅在serous和 BC 中观察到细胞周期基因集的富集，而在conducting airway的其他主要细胞类型中这些基因集几乎没有富集。
使用我们的 scRNAseq 数据集来询问 BC、IS 细胞和其他气道分泌细胞群之间的谱系关系。 通过 Velocyto 评估转录本剪接，以预测在对 PR8 感染的早期（初始第 11 天）和晚期（第 14 天第 240 天）反应期间 IS 细胞、club细胞和新生 BC 之间的分化轨迹。 细胞命运动力学的计算分析预测了一个过程，即 IS 细胞在 PR8 感染后的早期时间点去分化为 BC。 相比之下，轨迹分析预测 BC 在后期恢复时间点转变回 IS 细胞。
接下来使用 Visium 空间 RNA-Seq 来定义 PR8 感染 14 天后肺组织内新生 BC 和 IS 细胞之间的关系。 无监督聚类揭示了 7 个转录不同的基因特征，这些基因特征被投影到采样组织切片的空间图上。 将 scRNAseq 生成的细胞类型特征评分应用于空间 RNAseq 数据以共定位细胞类型。 正如通过 RNA 速度分析预测的这些细胞类型之间的谱系关系所表明的那样，由此产生的细胞类型空间图证明了新生 BC 和 IS 细胞之间的密切空间关联，但不是新生 BC 和club细胞。 分析证实了从空间转录组分析预测的新生 BC 和 IS 细胞的紧密空间定位通过 Scgb3a2 的免疫荧光定位到 PR8 感染小鼠肺泡上皮重塑区域内的 Krt5 免疫反应性区域。
Scgb3a2posScgb1a1neg IS cells demonstrate serous-basal-serous plasticity during repair following PR8
作者开发了一种谱系追踪方法来独立定义 PR8 感染后 IS 细胞和club细胞对 BC 扩增的贡献。单细胞和空间 RNAseq 数据表明 IS 细胞和club细胞都表达 Scgb3a2，但只有club细胞表达 Scgb1a1。基于这些数据，生成了双重重组酶 (DR) 小鼠，它们含有 Dre/Cre 报告基因等位基因以及 Scgb1a1-CreER 和 Scgb3a2-DreER 重组酶驱动等位基因。这些小鼠的Tamoxifen (TM) exposure导致 Dre 介导的表达 Scgb3a2 的 IS 和club细胞内的聚 A 信号 (STOP) 切除，随后 Cre 介导的 Scgb1a1 表达club细胞内的 tdT-STOP 切除。这些重组事件的结果是通过 tdT (Lin3a2) 的表达追踪 Scgb3a2+/Scgb1a1-IS 细胞，通过 eGFP 的表达追踪 Scgb3a2+/Scgb1a1+ club细胞（Lin3a2/1a1）。amoxifen exposure后是 9 天的清除期，然后对naive小鼠肺中的谱系追踪进行分析。 Scgb3a2免疫反应细胞在幼稚小鼠气道中的谱系标记被确定为75.2±3.06％，其中Lin3a2 IS细胞（总谱系标记细胞的16.8％）散布在Lin3a2 / 1a1俱乐部细胞（总谱系的83.2％）中 -标记的细胞）。仅在 tdT 谱系追踪细胞中检测到serous cell 标志物 Bpifa1 的表达，这些细胞对naive小鼠气道中纤毛和 BC 类型的标志物呈阴性。
接下来试图评估 Lin3a2 细胞对 PR8 感染后上皮重塑和 BC 扩张的贡献。 用 TM 处理的 3a2/1a1 DR 小鼠感染 PR8 流感病毒并在第 7、14 或 21 天进行检查。 在 PR8 感染后 7 天，在气道中发现了不断扩大的 Krt5+ BC populations。 谱系报告基因和 BC 标记 Krt5 的双重免疫荧光显示basal-like cells，包括Lin3a2-positive/high, -positive/low and - negative subset。 尽管检测到 Lin3a2/1a1 阳性上皮细胞，但在 eGFP 和 Krt5 之间未观察到免疫荧光共定位。 这些观察结果与其他人和我们的报告一致，即club细胞对肺损伤或感染引起的 BC pool的扩大没有显著贡献 。
在 PR8 感染后 14 天，Lin3a2-high 和-low 上皮细胞的进一步扩增明显，此时还在损伤肺泡上皮内的基底增生区域中观察到 Lin3a2-low/Krt5 双阳性上皮细胞。新生的 Krt5 免疫反应性basal-like cells在恢复第 14 天及以后显示出 Lin3a2 -low表型，而 Lin3a2-high上皮细胞主要是 Krt5 阴性免疫表型，并占据修复气道上皮内的suprabasal/luminal location。Expanding Lin3a2-high 细胞显示出 IS 细胞的特征，并且随着 PR8 感染后恢复的时间显示增加的丰度，这验证了 scRNAseq 的观察结果。有趣的是，在感染后第 14 天被basal-like Krt5 阳性/Lin3a2 低细胞重新填充的受损肺泡区域在恢复第 21 天显示出更大的异质性。到恢复第 21 天，占据肺泡区域的 Lin3a2 阳性细胞包括 Krt5-阳性/Lin3a2-low 和 Krt5-negative/Lin3a2-high 斑块，一些斑块似乎显示出暗示细胞状态转变的过渡表型。这些数据与 scRNAseq 数据的轨迹分析一致，表明 PR8 感染后扩增的新生basal-like 细胞最终转变回 IS 细胞。 Scgb3a2 的免疫荧光染色证实了肺泡 Krt5 阴性/Lin3a2 高细胞的 IS 细胞表型。我们来自双谱系追踪的数据证实了基于 scRNAseq 数据的细胞轨迹预测，并表明修复上皮是高度动态的。 PR8 损伤肺的环境变化有助于从气道 IS 祖细胞中鉴定新生 BC，然后它们在气道和受损肺泡区域分化回 IS 细胞.
Regulatory gene networks involved in immune-epithelial crosstalk are activated in nascent basal but not in IS cells.
接下来，defined调节在 PR8 感染小鼠肺部扩张的新生 BC 命运的机制。为了进一步了解调节 IS 或 BC 行为的途径，使用 Bigscale2(这个软件也是一个处理单细胞分析的软件，同时可以进行轨迹分析) 评估了 PR8 感染和恢复过程中调节基因的变化。 PR8 感染后 11-17 天的 ScRNAseq 数据按细胞类型排序，以产生四个调节基因网络 (GRN)。然后将感染后时间点的细胞类型特异性 GRN 与其各自的初始细胞对照进行比较，以标准化节点和边缘值。生成了前 300 个 delta 度节点中心的基因列表，并用于通过基于 Panther 的过度表示测试来识别丰富的基因本体 (GO) terms。下图 C 中显示的基因调控网络证明了 BC 之间发生的动态变化，但对于初始和感染后时间点之间的 IS 细胞则较少。基础群体中高度丰富的 GO terms包括涉及细胞增殖的途径，例如典型 Wnt 信号的激活，与观察到的 BC 增殖和伴随 PR8 感染恢复的相关增生一致。与细胞因子信号传导和上皮细胞先天免疫刺激相关的通路在 BC 中也显著上调，在从 PR8 感染的肺中分离的 IS 细胞中的调节程度较小。
先天免疫激活通常是对呼吸道病毒感染的well-documented response的反应，并且是导致气道重塑和出生后对过敏性炎症的易感性增加的上皮细胞命运的关键调节剂。值得注意的是，小鼠感染流感病毒后局部产生 TNFα 和 IL-1β 可促进肺泡上皮的再生能力，而 IL-22 可提高 PR8 感染后的存活率并减少肺纤维化。为了进一步探索细胞因子介导的上皮细胞命运变化的潜在作用，进行了多重蛋白质测定以量化流感病毒感染的 C57/Bl6 小鼠肺中的细胞因子反应。我们观察到干扰素 (Ifnγ) 和促炎细胞因子 IL-6、TNFα 和 IL-1β 显著增加，这与已知的呼吸道病毒感染反应一致。在 PR8 感染后第 5-11 天恢复期间，在小鼠的肺组织匀浆和/或支气管肺泡灌洗液 (BAL) 中观察到 17 型相关细胞因子（包括 IL-17α、IL-10 和 IL-22）的显著诱导。 IL-22 的保护作用以及细胞因子产生增加与气道和肺泡中 BC 扩张的巧合使我们推测 IL-22 信号传导在 PR8 感染后 BC 扩张中起作用。
Renewal and differentiation of nascent BC is regulated by γσT-cell derived IL-22.
为了进一步探索先天免疫激活和 IL-22 在调节 PR8 exposed 小鼠气道和肺泡上皮细胞中的作用，使用 scRNAseq 来定义因感染引起的免疫细胞群的变化。从 PR8 感染后不同时间收集的 CD45+ 肺细胞ScRNAseq 数据。整合数据的 UMAP 降维发现三个主要免疫亚群（T、B 淋巴和骨髓）的可视化。由 SingleR 识别和注释相似细胞的cluster。试图定义与恢复期间观察到的新生 BC 相关的这些主要免疫亚群的空间context。来自免疫富集 scRNAseq 数据集的基因特征用于推断空间 RNAseq 数据中的细胞定位。空间基因表达分析表明，在肺组织恢复中，T 淋巴亚群与富含 BC 的区域优先共定位，其中 17 型 γσT 细胞在 BC 增生期间显示出丰度增加。这使我们考虑 T 淋巴细胞对 BC 命运的可能的调节影响。
由于几个免疫亚群可以分泌 IL-22，分析生成了携带 IL-22Cre/ROSA-26-tdT 的小鼠，以在对 PR8 感染的修复反应期间绘制 IL-22 谱系免疫细胞的命运图。 为了鉴定表达 IL-22 的细胞类型，我们对 IL-22 谱系标签 (tdT) CD45+ 细胞进行gated以表达淋巴标志物 CD3 和 CD4。 我们发现 CD3+CD4-γδT 细胞亚群代表了响应 PR8 感染而引发的大部分 IL-22 系免疫细胞，CD3+CD4+ Th17 细胞的贡献很小。 有趣的是，非 T 淋巴样 CD3 亚群对 PR8 感染后表达 IL-22 的谱系没有贡献。 免疫荧光分析表明 IL-22 免疫反应性免疫细胞定位于新生的 BC 并在响应急性肺损伤时被诱导。
为了鉴定能够响应 IL-22 信号传导的上皮细胞类型，使用免疫荧光来鉴定哪些上皮亚群表达 IL-22ra1，这是赋予 IL-22 配体特异性的异二聚体 IL-22 受体的亚基。 值得注意的是，在幼稚小鼠的传导气道内，在有丝分裂后纤毛上皮细胞中观察到最高水平的 IL-22ra1 免疫反应性，在club, basal or serous cell中几乎没有观察到免疫反应性。 然而，在 PR8 感染后的恢复过程中，在增生性肺泡 BC 中观察到显著水平的 IL-22ra1 表达。 有趣的是，IL-22ra1 染色的强度在the outer periphery of pod region的外围内最大，表明在损伤期间对 IL-22 的基础反应性发生了变化。 总之，我们的数据表明，在调节 BC 命运的 PR8 损伤肺的新生基础群体中，IL-22 反应性改变的过程。
IL-22 promotes self-renewal of nascent BC, allowing hyperplastic expansion in airways and injured alveoli.
为了研究 IL-22 在 PR8 感染后对 BC 命运调节的贡献，我们使用 IL-22Cre homozygou (IL-22-LOF) 和 IL-22ra1fl/fl/Shh-Cre (IL-22ra1-cLOF) 小鼠分别调节 IL-22 水平和信号。与其相应的 WT 对照组相比，IL-22-LOF 和 IL-22ra1-cLOF 小鼠在 PR8 感染后体重减轻、病毒基因表达或实质 Pdpn 免疫荧光丧失均未显示显著变化。Next, we assessed expansion of Krt5-immunoreactive BC as a function of damaged area in IL-22-LOF mice following PR8 infection。在检查的所有时间点，与 WT 对照小鼠相比，在 IL-22-LOF 小鼠中观察到 Krt5+ BC 增生减少，这在第 17 天恢复时间点达到统计显著性。这些数据通过评估在每个时间点分离的总肺 RNA 中的 Krt5 mRNA 含量得到证实，为此在 14 天和 17 天恢复时间点观察到 Krt5 mRNA 的统计显著下降。在 PR8 感染后的 IL-22ra1-cLOF 小鼠中也观察到了类似的 BC 扩增减少的观察结果。
类似地，在其他组织和癌中，IL-22 调节上皮干祖细胞和肿瘤细胞的增殖潜力。为了评估在 IL-22-LOF 小鼠中观察到的 BC 增生减少是否与上皮增殖减少有关，我们在 PR8 感染后恢复期间通过 Ki67 和 Krt5 的免疫荧光测量了 BC 增殖指数。在 PR8 感染后 7 天观察到的 BC 的 Ki67 标记指数在 IL-22-LOF、IL-22ra1-cLOF 及其相应的 WT 对照之间没有差异。这些数据表明，PR8 感染后早期时间点的 BC 扩增以 IL-22 非依赖性方式发生，并且与观察到的幼稚对照小鼠或小鼠在感染后早期时间点的气道 BC 中缺乏 IL-22ra1 免疫反应性一致。 PR8 感染。然而，在 PR8 感染后 14 天，在 IL-22-LOF 和 IL-22ra1-cLOF 小鼠的气道和肺泡区域内观察到的新生 BC 显示，与其相应的 WT 对照相比，Ki67 染色水平显著降低。这些数据表明，在后期恢复时间点，IL-22 促进 BC 扩张和自我更新，从而维持增殖潜力。所有基因型都显示出降低的 BC Ki67 增殖指数，在 PR8 感染后 21 天，两组之间没有显著差异。为了确定在从 PR8 感染恢复期间缺乏 IL-22 刺激是否影响肺泡 BC 的命运，我们共染色了在 PR8 感染的 WT 和 IL-22 LOF 小鼠的实质组织中观察到的 BC 和 IS 标记物的pods。有趣的是，在 PR8 感染后 14 天，在 IL-22-LOF 或 IL-22ra1-cLOF 小鼠的肺中观察到的 Krt5 免疫反应豆荚显示 Scgb3a2 表达的证据，而野生型对照小鼠的可比 Krt5 免疫反应pods中不存在这种表达。显示 Krt5 和 Scgb3a2 免疫荧光共定位的上皮细胞组成的pod structures 的出现与显示 BC>IS 分化的早期数据一致，并支持残余 Krt5 免疫反应性反映分化 IS 细胞的 BC 起源的观点。为了进一步检查 IL-22 缺失对 BC 成熟的影响，在 PR8 感染 IL-22ra1-cLOF 小鼠或其相应的 WT 对照后 21 天，为从肺中分离的上皮细胞生成了 scRNAseq 谱。 UMAP 聚类证实了与 WT 对照小鼠相比，IL-22r1a-cLOF 小鼠肺中 BC 数量减少。与 WT 对照相比，在 IL-22r1a-cLOF 小鼠中观察到表达 BC 标记基因 Trp63 和 Krt5 的上皮细胞丰度显著降低。总的来说，我们的数据表明 IL-22 的作用是促进 BC 细胞的分化更新，并且在 PR8 感染后的后期时间点先天免疫反应的下调与 IL-22 的相关减少，可作为促进 basal to serous cell分化的触发因素.
Discussion
Basal cell (BC) 增生和受损肺泡气体交换区的定植是严重呼吸道病毒感染患者组织重塑和发病率的重要决定因素，并且与间质性肺病患者的远端肺重塑具有共同的特征。在这里，我们显示由 H1N1 流感病毒（PR8 株）感染小鼠呼吸道引起的新生 BC 主要来自肺叶内serous cell subset of intralobar secretory cells。新生 BC 与预先存在的 BC 的区别在于它们相对不成熟的分子表型和 IL-22ra1 的表达。先天免疫激活和 IL-22 的相关分泌促进了气道中新生 BC 的自我更新以及在受损肺泡内增生病灶的建立。上皮细胞内 IL-22 的种系缺失或 IL-22ra1 表达的条件缺失，限制了扩增并促进了新生 BC 过早分化为 serous cells。这些发现建立了一种新的机制，可以促进 serous cells的扩张及其在受损肺泡上皮的定植，导致上皮重塑和呼吸道病毒感染后正常肺泡上皮的丧失
提供证据证明在小鼠肺的叶内气道内存在两个独立的分泌细胞谱系，club细胞和intralobar serous (IS) 细胞。先前的谱系追踪研究表明，表达 Scgb1a1 的club细胞能够无限地自我更新和替换小鼠细支气管气道的特化上皮细胞类型。然而，PR8 感染小鼠肺部上皮细胞损伤导致非典型上皮祖细胞激活，导致 BC 增生。在严重呼吸道病毒感染的情况下，只有分泌细胞的 IS subsets可以承担 BC 的命运，这表明 IS 细胞作为储备上皮祖细胞发挥作用，如果对远端气道的稳态上皮维持有任何贡献，则不太可能发挥重要作用。流感病毒感染后 IS 细胞的扩增及其向新生 BC 的表型转化表明 IS 细胞在严重损伤后的上皮维持和修复中发挥着未被重视的作用。
单细胞空间联合的方法还是Seurat的方法，看来Seurat的方法还是最被大家认可
生活很好，有你更好