生信-单细胞分析 | scATAC分析踩坑记录

课题需要某一篇已发表文章的基于10x Genomics平台的scATAC-seq数据，于是乎，开始了踩坑指南。

No.1 数据下载

众所周知，公共数据的下载一般主要有GEO和ENA两个大的数据库，且由于ENA支持（或者说更便于）Aspera（特点：下载速度非常快，通常能达到百M/s），于是一般情况下，利用ENA的Aspera链接进行数据下载是我的首选。
▲ 然而，对于10x scATAC-seq的数据，这个方法会出现什么坑呢？
那就是网上很多人已经说过的，这一途径下载的文件不全，导致无法进一步用cellRanger-atac进行分析，因为总是会报错，有一个啥啥啥文件没找到。
（这一部分由于前期的试错和下载数据都删了，贴一下别人的：ENA和SRA数据库存放的单细胞转录组测序数据并不一致）

于是乎，我又开始了检索之路，那么如何快速从GEO下载呢？
▲ 首先GEO下载的SRA数据进行下一步分析的主要限速步骤有两个“
(1) 一个是下载：prefetch的下载速度大概是5-6M/s，一般下载一个scATAC-seq的SRA用时至少半个小时（可能有误，因为已经忘记了）
(2) 另一个是SRA转fastq：采用以往大家熟知的fastq-dump进行SRA到fastq的转化单个文件大约需要10-20min（也是大概时间，具体我已经忘了，至少我在今天早上8:46提交的fastq-dump，到9:34拆分完全）

fastq-dump转SRA为fastq

然后我找到了这个生信 | scATAC-Seq数据获取（超快sra转fq）
主要参考了这一部分：

Aspera + faterq-dump

No.2 SRA数据拆解为fastq文件

嗯。。速度确实很快，得到的fastq也是完整的4个。。一个缺点（在原本的文章中也提到了）就是fasterq-dump拆解的fastq不是.gz的压缩形式，这样需要较大的内存空间。

目前看起来似乎不错，于是乎，我开始了美滋滋的往下：
cellranger-atac
cellranger-atac count \ --id=$i \ --fastqs=scATAC/rawfastq \ --sample=$i \ --reference=refdata-cellranger-arc-GRCh38-2020-A-2.0.0 \ --localcores=8 \ --localmem=64
比对输出也没问题。

但是下一步我要利用cellranger-atac得到的bam文件进行进一步比对之后，出现了问题了：

bam报错

继续查找原因，终于看到了一篇有用的文章：bam转fastq一直WARNING，并且两个fastq结果文件都是空的

这个文章大概的解释是：”之所以这样报错，是因为SRR3286802-24999的两条reads（/1, /2）只有一条reads比对成功了，而另一条reads没有比对成功，所以在bam文件中没有mate的记录。”

由于没有在fasterq-dump中找到如上所述的--defline-seq定义reads name的参数，于是我不得不重新再转回SRA,再次利用fastq-dump来转换。

No.3 Fatsq-dump拆解SRA生成I1,R1,R2,R3

又一个众所周知的事情是，在运用fastq-dump时，我们需要加入--split-3 这个参数，否则拆解出来只会有一个被merge到一起的fastq.gz文件。
然而，--split-3确实只能拆出SRRxxxxxx_1.fastq.gz和SRRxxxxxx_2.fastq.gz两个文件，很显然，这样得到的fastq连ENA下载的3个文件都比不上。

那么到底怎么样才能得到有I1,R1,R2,R3同时又不会被改了reads name的fastq呢？
查看fastq-dump --help的帮助文件，我发现出了以往常用的--split-3这个参数，还有一个--split-files ，这一参数的描述为：Dump each read into separate file.Files will receive suffix corresponding to read number，于是我将fastq-dump的拆解命令写为：
fastq-dump --gzip --split-files --defline-seq '@$ac-$si/$ri' -O SRRxxxxxxx.sra
最终it worked, 成功得到了.gz形式的4个fastq文件。
开始测试下一步。如果再有坑再更新。