低级胶质瘤中EMILIN2的表达、甲基化和预后特征

Wang LC, Cui WY, Zhang Z, Tan ZL, Lv QL, Chen SH, Shen XL. Expression, methylation and prognostic feature of EMILIN2 in Low-Grade-Glioma. Brain Res Bull. 2021 Oct;175:26-36. doi: 10.1016/j.brainresbull.2021.07.013. Epub 2021 Jul 16. PMID: 34280481.
摘要
低级胶质瘤（LGGs）是中枢神经系统肿瘤中生长缓慢的脑癌。EMILIN2 是一种细胞外基质 （ECM） 蛋白质，可影响某些肿瘤的进展，这在 LGG 中尚不清楚。在本研究中，通过生物信息学分析分析了LGG中EMILIN2的甲基化、表达、预后和免疫价值。通过分析TCGA中的LGG样本发现 EMILIN2 表达与 EMILIN2 甲基化呈负相关，可能跟预后不良有关。同时，还在CGGA中进行了单变异和多变种的cox回归，这表明EMILIN2可能是LGG中一个独立的预后生物标志物。
Introduction
低级胶质瘤（LGG），常见的原发性恶性脑肿瘤，具有很强的内在异质性。二级和三级胶质瘤，患者生存期超过7年，统称为扩散低级胶质瘤。DNA甲基化是一种主要的表观遗传修饰，在各种癌症中得到了广泛的研究，它与肿瘤异质性有关。但EMILIN2与其甲基化之间的关系尚未在LGG中研究过。
EMILIN2 首次被确定为 116 kDa 细胞外基质糖蛋白，具有五个蛋白质域：C 端C1q域（C-terminal C1q domain）、前列腺富产域proline-rich domain）、胶原体域（collagenous domain）、线圈线圈域（coiled-coil domain）和 N 端半胱氨酸富含域 （N-terminal cysteine-rich domain）（EMI 域）。之前的报道称EMILIN2可以作为影响血管形成的关键微环境基因或乳腺癌中的抑癌基因。先前的研究报告说，EMILIN2在TCGA的LGG预后中起着至关重要的作用，然而，本文更加关注EMILIN2的甲基化值，并且，本文验证了自己的样本和CGGA数据库中的独立预测值，这些预测值在研究中尚未被探索。同时，EMILIN2表达和甲基化在胶质瘤中的临床和预后价值，特别是在LGG中，仍然不清楚。
在本研究中发现世卫组织III级胶质瘤中的EMILIN2表达明显高于世卫组织中国胶质瘤基因组图谱（CGGA）中的II级胶质瘤。同时，我们首次使用来自 TCGA 和 CGGA 的 LGG 数据确定了 EMILIN2 的预后作用，这意味着 EMILIN2 的高表达可以预测更差的预后。此外，回归分析表明，EMILIN2 是 CGGA 样本中 LGG 的独立预测因子。然后，还利用来自TCGA的LGG数据分析了EMILIN2DNA甲基化与EMILIN2表达与EMILIN2表达的预后意义之间的相关性。此外，通过GO和KEGG分析EMILIN2的生物过程，结果表明EMILIN2可能与免疫力有显著关系。此外，肿瘤免疫估计资源 （TIMER） 数据库用于评估 EMILIN2 表达和免疫渗透水平与其胶质瘤预后值之间的潜在相关性。最后，分析了EMILIN2与免疫渗透标记基因之间的相关性，确认了EMILIN2在免疫中的重要作用。EMILIN2在胶质瘤中的预后值通过定量反转录-聚合酶链反应（qRT-PCR）在我们自己的标本中得到证实，表明EMILIN2表达与胶质瘤的恶性肿瘤有关，并预测预后不佳。
数据来源
RNA-seq data 和临床信息 (n =1018, mRNAseq_693 and mRNAseq_325)在CGGA中下载。通过 Cbioportal 数据库 （https://www.cbioportal.org/） 和 UCSC-Xena （http://xena.ucsc.edu/） 从 TCGA 数据库下载450k甲基化数据（n = 530）。
患者样本
从中南大学湘雅医院采集了97个胶质瘤样本和18个脑外伤组织，并处理了临床信息。
结果
1.LGG 中 EMILIN2 表达和甲基化的临床和预后值
分析了II级（n = 258）和三级胶质瘤（n = 270）之间在LGG（n = 528）中EMILIN2的表达，发现EMILIN2表达显著增加，随着等级水平的增加（P <0.001）（图1A）。还观察到EMILIN2表达和EMILIN2DNA甲基化之间有明显的负相关性（r = 0.586，P <0.0001）（图1B）。图1C中展示了29个与EMILIN2DNA甲基化有关的CpG位点情况。生存分析表明EMILIN2的高表达(图1D)或低甲基化(图1E)可以预测整体生存能力差（OS）（P<0.001）。

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同时还对这些CpG位点都进行了生存分析，发现以下15个CpG位点与预后显著相关。（cg24276681，cg24948962，cg23405696，cg13765206，cg06769774，cg16181848， cg25813942， cg21266975， cg07483811， cg20679955， cg22349573， cg090 09111， cg07012770， cg07431339， cg00093099）

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从表1中果显示，EMILIN2表达与年龄（P <0.001）、癌症家族史（P = 0.04）、IDH突变（P = 0.003）和WHO等级（P <0.001）有显著关系。同时，EMILIN2 的甲基化与 IDH 突变 （P < 0.001）、等级 （P = 0.003） 和 KPS （P = 0.021） 相关。

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2.通过生物信息学分析，从CGGA中识别LGG中EMILIN2的预测和临床价值
从CGGA下载了1008名患者的RNA-seq数据和临床信息，以进一步验证EMILIN2的预后意义。N2。如图3A-F所示，EMILIN2的mRNA表达与按组织学（P<0.001）、癌症类型（P<0.001）、WHO分级（P<0.001）、MGMT突变（P<0.001）划分的组的临床信息（ P = 0.045)、1p19q 编码缺失 (P <0.001) 和 IDH 突变 (P <0.001）显着相关。EMILIN2的表达与临床参数密切相关。此外，我们进行了 Kaplan-Meier 分析以确认 EMILIN2 的预后价值，这表明高 EMILIN2 表达预示着较差的 OS。（图3G）

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3.EMILIN2 可能是 LGG 中的独立预测生物标志物
如图4A和4B森林图所示，EMILIN2可能是一种独立的预后生物标志物。

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4.EMILIN2 相关Gene Ontology和胶质瘤中的信号通路
通过皮尔逊相关性分析，从CGGA中识别出LGG中的EMILIN2共表达基因。有924个基因与EMILIN2的表达有关，p值<0.01和R>0.5作为cutoff。然后，我们进行了GO和KEGG分析，如图4C-D所示。发现EMILIN2的异常表达可能导致胶质瘤的免疫系统变化。

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5.EMILIN2的表达与胶质瘤中的肿瘤免疫浸润和相关标记有关
IMER数据库用于分析EMILIN2表达和免疫细胞浸润之间的相关性。EMILIN2 的表达与 B 细胞 （r = 0.391， P < 0.001）， CD8 + T 细胞 （r = 0.275， P < 0.001）、CD4 + T 细胞（r = 0.417， P < 0.001）， 树突状细胞 （r = 0.492， P < 0.001）， 巨噬细胞 （r = 0.51， P < 0.001） 和中性粒细胞 （r = 0.435， P < 0.001） 渗透，与 LGG 中的肿瘤纯度 （r = 0.279， P < 0.001） 呈阴性相关。此外，还探索了不同免疫细胞的预后值。如图5所示。

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据表2可知，TIMER 数据库中构建的Cox proportional hazard 模型显示，EMILIN2 表示是 LGG 中的独立预测风险标记（HR = 1.136，95%CI：1.097=1.579，P = 0.003）。

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同时还分析了EMILIN2表达与各种免疫细胞的许多免疫标记之间的相关性（表3），结果表明，大多数标记与EMILIN2表达密切相关，无论数据是否按肿瘤纯度调整。

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6.EMILIN2表达与胶质瘤的进展和恶性肿瘤有关，并预测了人类胶质瘤组织的预后
为了验证EMILIN2表达是否与恶性行为有关，进行了RT-PCR，以确定EMILIN2在正常组织（n = 18）和胶质瘤（n = 97）中的mRNA表达。观察到EMILIN2在胶质瘤中受到调节，EMILIN2表达水平与病理恶性肿瘤和不同等级有关（图6A-B）。为了进一步确定 EMILIN2 在胶质瘤中的预测值，对 Kaplan-Meier 进行了分析（图6C）。

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结论
研究发现EMILIN2的表达随着LGG等级的提高而增加。EMILIN2在WHO三级中的表达能力高于在TCGA和CGGA的数据中的二级LGG，这表明EMILIN2的改变表达可能显著调节LGG的进展。此外还分析了EMILIN2表达与甲基化的相关性，发现EMILIN2的表达与LGG中的EMILIN2甲基化呈负相关。从CGGA数据库中确定了EMILIN2的预后和临床价值。几乎所有位点都与预后相关。EMILIN2表达与免疫细胞标记之间的相关性表明EMILIN2可以调节LGG的肿瘤免疫力。
总之，EMILIN2表达与EMILIN2甲基化呈负相关，可能助长胶质瘤的恶性和免疫渗透的调节，EMILIN2可能是LGG中的潜在生物标志物。