工作中遇到的文献，反正都要看，顺便做个笔记，文章影响因子不高，重点是思路和方法，文章方法上用了支持向量机（SVM），线性判别分析（LDA），KNN临近法，贝叶斯法（Bayes）。（深感排版难用，大概是我不会用吧~）
摘要：
胃肠胰神经内分泌瘤的发病率和患病率在增加。此类病的延迟确诊很常见，CgA单一指标诊断是不准确的。文章中通过三个微阵列数据集的计算分析来鉴定NEN，样本包括NEN组织15例，NEN外周血7例，腺癌363例。在130份血液样本（NENS63例），中检测候选基因，在两个独立组中验证，第一组n=115，NENs=72，第二组n=120，NENs=58。对176份样本进行了CgA比较。基因分类其在独立的集合中检测到NENs，具有高度敏感性（85-98%），特异性（93-97%），PPV（95-96%）和NPV（87-98%）。比较来说分类器的AUC为0.95-0.98，CgA为0.64，分类器比CgA更准确。在亚组分析中，胰腺和肠胃中具有相似的效果（79-88%敏感性，94%的特异性）。
材料：
人类癌症和正常微阵列数据集：数据库地址为http://www.ebi.ac.uk/arrayexpress
延伸：数据库文献：Parkinson H, Kapushesky M, Kolesnikov N, Rustici G, Shojatalab M, et al.(2009) ArrayExpress update–from an archive of functional genomics experiments to the atlas of gene expression. Nucleic Acids Res 37: D868–872.doi:10.1093/nar/gkn889
GEP-NEN数据1：包括小肠组织3例，原发性GEP-NEN6例和转移性GEP-NENs3例。
GEP-NEN数据2：包括正常回肠粘膜6例，原发性中肠3例，肝转移3例。
公共癌症微阵列数据集：三个肝癌细胞癌数据集：酒精性HCC（n=65），病毒性HCC（n=124），进展性HCC（n=75）；乳腺癌（n=86），结肠癌（n=47），前列腺癌（n=154），正常人体组织（n=158）。
此外还检测了外周血基因表达，为此检查了14个样本（对照7个，GEP-NENs7个）。
分析方法：
训练组：130份血液样本，对照组67例，GEP-NENs63例
独立验证集：第一组：115例样本。对照组43例，GEP-NENs72例；第二组：120例样本，对照组49例，GEP-NENs71例。
（实验中的方法不是我关注的点，我就一个数据分析的娃，真的不懂也不care那些，担心翻译错了，觉得有用或者感兴趣的娃，可以自己看）
分类算法：基因表达值log转换到1-100之间。采用10折交叉验证设计，在训练数据集上进行建模。在内部训练集中，差异表达基因用t检验。利用上调特征（ps：此部分不知道为什么选择上调的基因）对四种不同的学习算法包括支持向量机（SVM），线性判别分析（LDA），K临近分析和朴素贝叶斯（Bayes）进行内部训练。为了控制过拟合，在2个验证集中进行验证。对照样本和GEP-NEN的一致性标签是通过多数票方法产生。
详细介绍：
1.候选基因的选择
1.1基因共表达网络： 比较GEP-NEN和其他癌症数据集之间的共表达网络分析，此外还用GEP-NEN和正常人体数据集（79种不同的的健康组织和细胞类型，共计158个阵列）比较，以消除由于健康组织可能发生的共表达。GEP-NEN基因共表达网络：1）保留GEP-NEN数据集中重复的共表达对，2）从GEP-NEN网络中消除其他癌症和正常组织的基因共表达，3）消除GEP-NEN-A，GEP-NEN-B网络不同变化的基因。
该分析产生了2892个基因和30444个共表达，我们关注的是这个网络中最大的连接组件（2545个基因的30249个连接），其中包含了99%的共表达信息。重要的是基因共表达网络不试图识别“直接基因相互作用”，二是包含“基因邻域关系”，这在传统的微阵列分析中常被忽略，并用来识别在共同途径或生物过程中发挥不同作用的基因。因此，共表达网络的功能表征应该被视为一种描述性分析，旨在产生附加的假设检验。
1.2GEP-NEN基因共表达网络功能分析：为了深入了解GEP-NEN网络部获得分子通路，使用DAVID富集相关通路。Integration of energy metabolism富集到58个基因，p=4.2*10^(-5);Diabetes pathway富集到68个基因，p=2.7*10^（-4）;Pathways in cancer富集到72个基因，p=0.003，其他途径包括免疫反应，神经系统发育和代谢。之后使用Louvain算法，通过模块化最大化将阶段迭代分组区域中，将GEP-NEN网络划分为62个簇，分别在最大和最小的簇中有800个和3个基因。
补充：Louvain算法
1.3Marker基因的选择：我们产生了三个推测的标记基因面板，通过RT-PCR进一步检测：1）组织，2）外周血，3）文献，此处要看补充方法了。后边有时间加上。为了生成给予组织的基因面板，我们在GEP-NEN-A和GEP-NEN-B数据集中发现了显著上调的基因，摒弃保留了GEP-NEN基因表达网络中也存在的基因。随后，我们保留了具有高网络聚类系数的基因，基于他们与肿瘤发生关联的可能性增加。最后，查找了一组369个基因，这些基因通过阈值过滤，和文献手动搜索，搜索标准：A)神经内分泌瘤，B)肿瘤形成，C)转移。369个基因中21个被选择用于PCR。14个外周血样本（n=7个对照组，n=7个GEP-NEN组成），1382个上调基因，仅保留GEP_NEN-A，GEP_NEN-B阳性的，产生306个假定的标记基因。手动文献搜索，查找与内分泌生物学或者是内分泌肿瘤相关的基因，确定了32/306个PCR验证的靶点。
文献中查到的基因共22个，13个标记基因在之前报道中与GEP-NEN相关，另外9个和肿瘤的发生和转移相关。在这些分析的基础上，选择了75个假定基因，做PCR分析。
2.在测试集和独立集中验证GEP-NEN标记的基因
为了验证“假定”标记面板，测量了从训练子集（对照49个，GEP_NEN28个）中分离出的mRNA的转录水平。这表明75个候选标记中有51个在血液中能产生可检产物。使用51个标记基因识别GEP-NEN，将GEP-NEN分类器建立在训练集（对照67个，GEP63个），用t检验计算对照组和肿瘤病理的显著性，采用四种分类算法（SVM，LDA，KNN，Bayes）和10倍交叉验证设计，建立了GEP-NEN诊断分类器。支持向量机的精度为0.89（0.85-1.0），LDA算法0.89（0.86-0.93），KNN精度0.88（0.85-0.93），Bayes精度0.86（0.85-0.93）。3中分类器的投票组合准确率为0.88。为了控制过度拟合和评估分类器的性能，我们检查了两个验证集，验证集敏感性为85%-98%，特异性为93%-97%，PPV为95-96%，NPVs87-98%，第一和第二个验证集测试AUC分别是0.98,0.95。
51个标记基因和Chromogranin A对GEP_NEN的识别比较。为了检查外周血PCR特征的效用，我们将其与一组176个样本的组中CgA的测量结果进行比较，与对照组相比，GEP-NEN中CgA升高P=0.002。采用19Units/L作为临界值，敏感性为32%，特异性99%，PPV96%，NPV63%。正确率为68%。PCR的方法比CgA的方法更准确。特异性相似（94%vs99%），敏感性高于CgA（85%vs32%）。
3.GEP_NEN标记基因的额外作用
为了进一步评估标记基因的潜在作用，检查前神经基因和胃肠道神经基因的敏感性和特异性是否存在差异。以及是否可以检测到非转移性肿瘤。此外我们还想测试在低CgA表达患者中表达如何。我们分别见擦了每个验证集以及两个集的组合。识别P-NENs性能指标：敏感性为64-100%，特异性为92%=95%。43个胰腺癌种特异性为94%，95例胃肠道肿瘤中特异性为94%。两者没有显著性差异，表明PCR检测在两种癌种中结果相似。
对转移瘤的评估发现，中的敏感性和特异性85%，11例无转移瘤患者中91%为阳性，特异性94%，不论是否转移，PCR都能很好的鉴别出患者。
176个CgA样本数据集使用19U/L为临界值，确定了55名低CgA患者，50例患者的PCR评分为0.2分（91%）。在26例CgA升高的患者中22例（85%）PCR评分升高。PCR评分显著高于CgA。
搞完了，都没看懂他的样本到底怎么用的