BSA专题2—缩小定位区间和后续验证怎么做？

导语：又是一周打工人的开局，小编又来啦，来兑现上一专题说的BSA定位后的缩小候选区间&相关实验内容整理哟~

缩小候选区间的方法总结如下：

☑与遗传图谱结果相结合，基于表型数据，进行QTL定位，与BSA结果相结合；

☑开发SNP或者InDel分子标记，通过大群体性状与分子标记的共分离缩小候选区间；

☑结合RNA-seq结果，选取具有显著差异表达的或某显著富集通路上的基因作为候选基因。

☑结合相关性状的文献报告，基于序列同源、基因的功能或者相关突变类型（如EMS），锁定候选基因；

后续验证方法总结有：

☑将候选标记转化为CAPs（dCAPs）、凝胶电泳或者一代测序进行验证；

☑基于RNA-seq的差异表达分析，看基因是否有显著表达差异；

☑转基因验证基因功能，如基因敲除，过表达、RNAi等；

☑RT-PCR验证候选基因的表达模式。

☑蛋白质水平检测基因表达：选择相应的组织以WB等检测目的蛋白的表达。

先来一个科研人员关心的内容吧—看看BSA具体发表的文章，看到这么多IF，是不是眼馋的很，原来BSA小可爱也能发大文章。下面我们一起捋捋，借鉴借鉴吧，也许下个高分文章就是你！

学习高分文章研究思路—做到开题心中有数：

1、如果你的传统定位实验由于标记缺失走不进去，请看这！

BSA定位黄瓜花和卷须形成的关键基因—CsUFO

本文基于实验室的图位克隆，定位到一个124kb候选区间，内有21个候选基因，逐一验证工作量大，最主要周期长，常规定位走不进去，这时借助BSA方法，和EMS诱变的突变特点（即G:C变为A:T），在候选区域内找到一个突变候选位点，并成功验证上。所以如果候选区间无常规标记进一步缩小区间，不妨参考下此文，也许有不一样的收获。

2、如果你的BSA结果候选区间比较大，请看这！

BSA定位四倍体棉花的叶色突变表型

BSA-seq分析方案：

第一步：将v1突变体与野生型杂交构建BC1子代，根据突变体和野生型表型进行分离。

第二~五步：将突变体亲本T582株与28株突变体子代进行测序和BSA分析，定位在chr20:0.7~3.9cM内。

实验室图位克隆验证：

第六步：将T582与TM-1杂交产生F1代，F1自交得到2164个F2子代，其中483个极端基于274个多态性SSR构建遗传图谱，定位区间接近（验证了BSA结果的准确性）。

第七步：基于BSA测序中分析出的T582与参考基因组间的126541个InDel，筛选出候选区间内83个InDel，加密作图标记进一步缩小到1.5cM。

第八步：基于另一个有2622个个体的作图群体，最终精细定位到44kb内。

第九步：候选区间有8个ORF，比对TM-1和T582之间编码区序列变异，找到ORF1和ORF4的一个外显子各存在非同义突变SNP。对503个绿色F2个体进行连锁分析。结果显示只有ORF4中的SNP与v1基因座共分离。表明该SNP是T582中v1表型候选位点。

由本文工作内容可见，BSA直接拿到基因固然可喜，但大多数情况是区间很大，后续缩小区间的工作量不容小觑（这里可以思考下，为什么放大作图群体呢？答案关键词当然就是重组交换事件啦）。

拿到基因后续如何丰富文章内容，使故事更丰满呢？看一看高分文章的秘诀吧！