文献阅读——原发性和转移性肿瘤中克隆扩增的EOMES+Tr1样细胞与疾病进展相关

——by不是杀杀
Nature immunology
2021 May 20
IF:20.477
PMID:34017124
该文章基于原发性非小细胞肺癌和结直肠癌单细胞转录组测序数据的分析，发现CDS4⁺T细胞中有两类细胞亚群在这两种癌症中具有高度相似的特征基因，之后进一步通过流式细胞技术对scRNA-seq的分析结果进行蛋白质层面上的验证，并在多种不同肿瘤、癌症不同阶段以及转移性肿瘤中对这类细胞亚群进行观察，发现这类细胞与癌症的进展相关，并且能够抑制抗肿瘤免疫应答。

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背景

在免疫系统中CD4⁺T淋巴细胞可以协助B细胞和CD8⁺T细胞，并协调抗肿瘤免疫应答。CD4⁺调节性T细胞（CD4⁺ T_reg）可以通过抑制自身反应性T细胞来抑制免疫应答，维持组织稳态，同样这个特点也能够被肿瘤细胞利用，促进肿瘤的生长，因此CD4⁺ T_reg浸润肿瘤往往与不良的预后相关。经典CD4⁺ T_reg的特点是表达转录因子叉头盒蛋白 P3 (FOXP3)[FOXP3⁺ CD4⁺ T_reg]。
此外，几项研究表明FOXP3^- CD4⁺ T_reg，通常称为1型调节T细胞（Tr1）能够基于细胞毒性和产生白介素10（IL-10）来抑制免疫应答。目前研究表明FOXP3^- Tr1细胞可能能够调节抗肿瘤免疫反应，但对于这类细胞的分子特征和临床关联是未知的。

方法

Experimental Workflow

结果

1.

在非小细胞肺癌（NSCLC）和结直肠癌（CRC）的单细胞转录组测序中，对CD4⁺ T细胞进行降维聚类，分别定义了9个和11个细胞亚群，通过差异表达分析得到每个细胞亚群的差异基因，选取在不同肿瘤间具有保守性的特征基因作为每个亚群的名称。通过秩篇重叠度量（一种用来描述排序列表相似性的度量方法）来比较NSCLC和CRC中CD4⁺ T细胞亚群之间差异表达基因的相似性。从图中可以看出CRC中类3和NSCLC中的类3以及CRC中类4和NSCLC中类6具有高度的相似性。
进一步分析发现CRC和NSCLC中类3差异表达FOXP3、MAGH1、TIGIT、OX10以及IL2RA等典型肿瘤浸润性 T_reg细胞的分子特征。在CRC类4和NSCLC类6中发现其差异表达EOMES和GZMK等。

为明确定义这两个细胞亚群是否是FOXP3⁺和EOMES⁺细胞群，进行了基因集富集分析（GSEA），使用的参考基因集为先前研究中基于大量RNA-seq得到的CD4⁺ FOXP3⁺及CD4⁺ EOMES⁺细胞的特征基因，富集分析结果表明这两类细胞与先前鉴定的CD4⁺ FOXP3⁺和CD4⁺ EOMES⁺细胞具有高度相似的分子蓝图。此外单细胞转录组分析表明GZMK在识别出的EOMES⁺亚群中表达显著上调。

小结：上诉工作确定了具有潜在抑制功能且在不同肿瘤中显示出高度相似性的两类细胞。

2.

为在蛋白质水平验证单细胞转录组分析的结果，对48个非小细胞肺癌样本和28个结直肠癌样本进行流式细胞分析，分析结果表明EOMES阳性细胞大部分会表达GZMK，但GZMK阳性细胞仅有小部分表达EOMES。同时实验表明，GZMK阳性细胞缺乏CNLY、CD25、FOXP3等蛋白的表达，而这些蛋白是T_reg细胞的特征。

GZMK⁺细胞表达CCR5及PD1，这些是产生IL-10的效应T细胞的标志物。结果还指出，相比于GZMK^- EOMES^-细胞，仅有GZMK⁺ EOMES⁺细胞产生干扰素γ（INF-γ）和白介素10。

从新鲜的肿瘤组织中纯化EOMES⁺ Tr1样细胞，与CD4⁺T细胞以不同比例混合培养，发现其能够抑制CD4⁺T细胞的增殖，且抑制程度与传统的FOXP3⁺ T_reg细胞相当。同时EOMES⁺ Tr1样和FOXP3⁺ T_reg细胞都能够抑制CD8⁺T的增殖。

小结：研究定义了一种肿瘤浸润中CD4⁺ EOMES⁺ Tr1样细胞亚群，该细胞亚群以GZMK的表达、白介素10的产生以及能够有效抑制T细胞增殖为特征。

3.

不同部位及不同癌症等级中EOMES+ Tr1样细胞的累积

使用流式细胞技术从肿瘤组织、癌旁组织、外周血中分离CD4⁺T细胞，可以看出EOMES⁺ Tr1样细胞在肿瘤组织显著增加，且表明肿瘤浸润性EOMES⁺ Tr1样细胞与肿瘤进展之间存在关联性。

从结直肠癌伴肝同步转移肿瘤scRNA-seq数据中同样能够识别出这两类细胞亚群，通过GSEA可知这两类细胞与原发性肿瘤中的两类细胞高度相似。

来自公共数据库的肝癌、乳腺癌和黑色素瘤scRNA-seq数据

在其他癌症数据的分析中，同样能够鉴定出这两类细胞，并与之前识别出的这两类细胞具有一样的分子蓝图，说明这两类细胞在不同癌症中高度富集，具有保守性。

小结：这些发现表明EOMES⁺ Tr1样细胞和FOXP3⁺T_reg细胞在不同的肿瘤类型和转移灶中都高度富集，表明他们都有助于抑制原发和转移部位的免疫应答。

4.

结合TCR谱分析，发现EOMES⁺ Tr1样细胞具有最高的克隆扩增指数（图a）；在结直肠癌的3个样本中均显示出扩增的EOMES⁺ Tr1样细胞，一半以上EOMES⁺ Tr1样细胞具有共享的TCR克隆型（图b）。此外，EOMES⁺ Tr1样细胞与FOXP3⁺T_reg细胞之间的克隆共享情况表明这两类细胞具有独立的起源（图c）。图b中Morista重叠指数实现了TCR克隆重叠的定量测量（每个点代表一个细胞亚群，大的大小表示细胞数量的多少，线的粗细表明共享TCR的数量多少），发现EOMES⁺ Tr1样细胞与多个细胞亚群具有较多的TCR克隆共享，这暗示EOMES⁺ Tr1样细胞可能由某种CD4⁺T细胞终末分化而来。

选出与EOMES⁺ Tr1样细胞具有最多TCR克隆共享的细胞亚群，进行GSEA鉴定，发现它们与1型辅助T细胞（T_H1）具有相似的分子蓝图，此外，体外实验表明在IL-4条件下通过CD3刺激仅有T_H1细胞诱导上调了EOMES基因的表达。

小结：这些数据表明EOMES⁺ Tr1样细胞可能是来源于肿瘤微环境中1型辅助T细胞的终末分化细胞。

5.

为评估EOMES⁺ Tr1样细胞对预后的影响，需要寻找一种可以在所有细胞类型中识别出这类细胞的分子标志物（由于EOMES在CD8⁺ 细胞中也有表达，因此不能用它作为直接标志物）。分析发现CHI3L2基因在EOMES⁺ Tr1样细胞中显著差异上调，该基因表达一种分泌蛋白，这种蛋白在细胞中具有生长因子活性。

将样本分为CHI3L2高表达和低表达组，生存分析表明CHI3L2高表达的样本具有较差的预后。但有趣的是，通过PD1抑制剂治疗后的样本中，CHI3L2高表达组表现出了更好的生存，且体外实验表明EOMES⁺ Tr1样细胞抑制CD8⁺T细胞增值的能力在PD1抑制剂存在的情况下降低，表明其与对抗程序性细胞死亡蛋白 1 (PD1) 的反应相关，极有可能成为癌症免疫治疗的新靶点。