质粒系列之限制性克隆--restriction cloning

我们用两篇文章的篇幅大概讲了一遍质粒的骨架及其各个要素的介绍：
解剖式学习一个质粒结构--update
质粒系列之什么是质粒
简单梳理就是质粒大框架+小元件：大框架包含质粒复制起点，启动子，表达元件以及筛选标记，为了达到特定目的或细化功能，需要引入带有各种功能的小元件，而所有达成这个目的质粒元件拼凑行为，我们统称之为质粒重组。接下来我们会介绍几种常用的质粒克隆技术。

今日我们从最传统的质粒构建方法--限制性克隆开始说。

质粒命名

在开始之前我们简单讲一下质粒命名。质粒命名虽没有明确的规则，但也有一些约定俗成的命名习惯，可以帮助人们快速识别质粒特性。

1. 小写p开头 ，p在这里指代质粒（plasmid），所以我们常常看到pXXXXX-XXXX。

2. 质粒骨架 p后面接上质粒骨架名称，pBACKBONE-XXXX。质粒骨架中包含promoter等等重要信息，一旦你对这个骨架熟悉，通过名称则很快能推测出质粒元件。addgene有专门的Vector Database可供查阅许多已发表或商业化的质粒空骨架信息。

3. 插入的基因名，pBACKBONE-hGene，可以看到h在这里的意思是human。在质粒命名中经常会用小写字母来代替物种，小鼠m，大鼠r等等。对于Cas9会写SpCas9，Sp则意为 Streptococcus pyogenes （化脓性链球菌）。

4. 贴Tags，通常插入的基因还会带有flag，需要按照出现顺序给出信息，比如我们前面文章提到的NLS-Cas9-NLS，这意味着Cas9前后各有一个核定位信号NLS，以保证Cas9的和核定位。

5. 标记突变信息，插入的基因时常带有特定突变，因此需要额外标记出来。而突变通常使用氨基酸表示，如Q295A代表：第295位谷氨酰胺（Glutamine）突变为丙氨酸（Alanine）。

以上是质粒命名的一些通用规则，有时候质粒不一定严格按照以上规则命名，但可以举一反三，窥得其中一些规律。

例子：

(1) pSpCas9(BB)-2A-GFP (PX458)：以PX458为骨架，带有SpCas9表达元件，SpCas9后连接有2A-GFP元件，2A用于自我断裂，将Cas9和GFP分开，而GFP则作为筛选标记。

(2) px458_2A_GFP_sgRNA_TIAL1：以PX458为骨架（该骨架带有SpCas9），带有2A-GFP元件用于断裂和筛选，同时表达针对TIAL1基因的sgRNA，因此该质粒可用于TIAL1基因敲除，并且可使用GFP筛选。

(3) pLenti-U6sgbbBsmbI-puro-2A-Fluc：慢病毒骨架质粒，带有U6启动子，奇怪名称sgbbBsmbI（由于这是一个空骨架质粒，盲推这是酶切位点？）的sgRNA，筛选标记是puromycin，同时还会有荧光素酶表达用于体内成像。

限制性克隆

1. 简介

限制性克隆是我们最常用的克隆技术，不仅操作便捷，单位价格低廉，还特别好使。限制性克隆，顾名思义，即使用限制性内切酶切开载体，并插入一段拥有适配酶切位点的片段，如下图：

RESTRICTION CLONING

2. 注意事项

在设计和进行限制性克隆实验时，需要考虑以下几点条件至少有以下几点：

最重要的是需要有合适的酶切位点。因此在选择质粒骨架的时候，我们偏爱那些具有多克隆位点（Multiple Cloning Site，MCS）的质粒。当然质粒骨架有MCS还是不够的，实验室还得储备足够多种类的酶，可选择的酶的缓冲液还需兼容。需要注意，限制性内切酶可产生粘性末端或平端，由于平端末尾会对末端原始序列造成改变，由此可能使得翻译区出现移码突变等，且平端的连接通常难度更大，因此能选粘性末端绝不选择平端。我们有经常为酶切位点的贫瘠而跳脚，因为酶缓冲液不兼容而不得不分开酶切的经历。这个问题需要靠运气和财力解决。

[图片上传失败...(image-d30ad9-1628078172797)]
最好是插入片段本身就有适配的酶切位点。如若没有，则可以设计带有酶切位点的Primer，通过PCR扩增出带有酶切位点的插入片段。当然在设计primer上的酶切位点时，记得加入几个保护碱基。拥有适配酶切位点的情况不多，大多数情况我们受限于骨架质粒以及插入片段没有适配的酶切位点，通过PCR的方式人为加入酶切位点是很常见的解决方式。除此之外，还可以将插入片段连接到一个拥有MCS的中间质粒，而中间质粒的MCS则包含骨架质粒所需的酶切位点，通过酶切中间质粒曲线救国。
为保证足够多的连接材料，骨架质粒和插入片段的起始原料要足够多，在只做一次插入连接的情况下，我们一般会选择至少2 μg的骨架质粒在2x50 μL体系中进行酶切，最后进行凝胶电泳回收（以下简称“胶回收”）纯化。在实际试验过程中，骨架质粒以及插入片段的酶切产物是越多越好，因为未必能一次连接成功，重来的概率不低。为解决这个问题，可以选择使用更大的酶切体系以获得更多的原材料，同时原材料的酶切要尽可能完全。
保证所有的原材料“干净”，为长远计，我们建议所有的初始原材料最好都经过胶回收进行纯化。
去磷酸化防止载体自连。载体自连容易发生在载体酶切后的末端是平端或互补时。由于连接酶连接载体时，需要有5’磷酸基和3‘-OH的存在才可环化。因此可以在酶切后使用碱性磷酸酶去除5’磷酸基，这个过程也叫做末端钝化（blunting）。目前常用的有 小牛碱性磷酸酶（calf alkaline phosphatase，CIP）和虾碱性磷酸酶（shrimp alkaline phosphatase，SAP） 。

5'磷酸基-3'OH
末端磷酸化帮助克隆连接。在DNA连接步骤，骨架质粒和插入片段都需要有5‘磷酸基。去磷酸化的骨架质粒和PCR扩增的DNA产物都需要进行5’磷酸化。在这里常用T4多核苷酸激酶（T4 Polynucleotide Kinase，T4 PNK ）对 5’端重新磷酸化。

3. 案例分析

在SnapGene等相关软件中，我们可以很好的模拟限制性克隆的过程（也不是所有过程都可以模拟），我们以以下为例，举例一个不太常规的限制性克隆实验。

3.1 目的：更换mCherry为DsRed(FRT)GFP元件

aim

如上图所示，插入片段两端的酶切位点和骨架质粒酶切位点并不兼容。在这种情况下，我们可以将左侧质粒的DsRed(FRT)GFP片段插入到一个包含MCS的中间质粒，再利用中间质粒的酶切位点与骨架质粒酶切位点兼容。

3.2 设计和实验过程

因为觉得插入中间质粒有点麻烦，所以我们决定设计使用PCR扩增DsRed(FRT)GFP片段并在primer末尾加入酶切位点，具体设计如下：

design

实验过程如下：

（1）设计PCR 引物，并在primer末端加入BsrGI酶切位点于GFP元件末端，同时在酶切位点外部加入4个保护碱基。常规情况下，左侧还应该再重构相应的酶切位点，然而因为骨架质粒中我们选择的HpaI酶切位点产生的是平端末尾，因而左侧不再重构酶切位点。对DsRed(FRT)GFP扩增产物进行酶切并胶回收。

primer design

（2）对骨架质粒66.2272.CAG.mCherry进行HpaI+BsrGI两步酶切（因为两种酶的buffer不兼容）。可选择对酶切产物进行去磷酸化（当时并没有做）。

（3）使用T4连接酶连接→→感受态转化→→涂平板、挑菌落、质粒提取、测序验证、转染验证。

结果如下：

result

最后

构建质粒各种步骤、各种困难，下面我们提供一个一步到位的办法，那就是：

买买买

相信大家都曾有过或现在都还有的一种想法（包括我自己），那就是作为博士生，你必须什么都会，凡事都要亲力亲为，不要想着买（尤其PI）。总觉得这个实验如果通过付费轻轻松松就达成，你不配被称为博士生。

在目标质粒是可获取的（尤其Addgene上质粒很便宜），还是要自己折腾个十天半个月，成功就还罢了，不成功的话还需要各种解决bug，花费大量的精力和试剂耗材在质粒构建上，也不过是做出了一个工具，与课题进度甚至无关，仔细算下来，还不如直接购买质粒划算。本人现在有一种感觉，质粒就抗体一样（毕竟大部分实验室不会想要自己做抗体，不排除一些实验室自己有实力，也是自己做的），不一定非要自己构建，除非非常简单或没得选择。