【RNA-seq自学02】RNAseq的原理及流程

RNAseq是一种高通量测序技术。它可以帮助我们理解在各种比较条件下，所有基因的表达情况的差异。可以检测的差异有：正常组织和肿瘤组织的之间的差异；也可以检测药物治疗前后基因表达的差异；还可以检测发育过程中，不同的发育阶段，不同的组织之间的基因表达差异。同时，还可以检测 RNA 的结构上的差异。例如：mRNA的剪接方式的差异，也就是我们一般说的可变剪接，还可以检测融合基因，同时还可以检测基因单点突变导致的SNP（Single Nucleotide Polymorphisom)。

原理

使用下一代测序（NGS）来揭示给定时刻生物样品中RNA的存在和数量，并分析不断变化的细胞转录。

1、提取mRNA，逆转录为cDNA

2、切割片段，测序起始原件，扩增，片段大小选择

3、建立的cDNA文库

4、将文库放到高通量测序器上进行测序

5、测到基因不同的拷贝，与基因组模板比对

6、通过计算机方法将其拼接起来

RNAseq的原理

有参考基因组（左）和无参考基因组（右）

流程

1、试验设计

2、RNA纯化【注重纯化质量】

3、建库

PolyA mRNA富集和片段化、反转录、互补cDNA合成、末端修复、加A和接头（测序原件adaptor）、PCR富集

分离RNA=》将RNA打断成小片段=》将小RNA片段反转录成DNA=》加接头=》PCR扩增（只有加上接头的测序片段才能被扩增）=〉质量检查QC（看下文库的浓度和片段长度）

接头两个作用：测序仪识别；允许一台测序仪同时运行多个样本，提高性价比

4、上机

5、样品分析【检测样品是否可用】

QC质量评估、参考基因组对比

6、数据分析【数据如何使用，如何阐释data】

差异表达基因GO功能分析、样本的可变性剪切、差异可变性剪切分析(MATS)、新转录本功能注释

参考：实验万事屋

https://www.bilibili.com/video/BV1KJ411p7WN?p=7