circRNA的常规分析思路也可以乘风破浪，斩获高分。近年来，circRNA像一颗冉冉升起的星星，受到广大科研工作者的青睐，现在已经到了炙手可热的地步，细数近年来circRNA在国家自然科学基金获批项目的情况，早就已经成为非编码RNA界的研究热点。
文章简介：
本篇文章1发表在Molecular Cancer上，在最近一年的影响因子为27.401比上一年增加了12.099。这篇文章发现并证明circRNF220对儿童AML的准确诊断可能是高效和特异的，并对复发预测有一定的意义。
背景知识：
环状RNA(circRNAs)是一个具有独特结构的转录本家族，已被证实在肿瘤发生中起关键作用，是潜在的生物标志物或治疗靶点。然而，在儿童急性髓系白血病(AML)中，只有少数circRNA具有功能特征。
思路总结：
结果解读：
儿童原发性急性髓系白血病circRNAs谱分析
散点图可视化显示，circRNA的表达水平是可变的，并且在不同的组之间是可以区分的(Fig.1A)。共有1,960个circRNA在急性髓系白血病和对照样本之间差异表达，其中1001个circRNA表达上调，959个circRNA表达下调。染色体1和2含有大量差异表达的circRNA(Fig. 1B-C)。在急性髓系白血病中，大多数差异表达的circRNA是从外显子转录而来的(Fig.1D)。大多数异常circRNA的长度小于1500个核苷酸，中位数长度为372个核苷酸(Fig.1E)。然后，通过系统聚类法确定了前10个上调和下调的circRNA (Fig. 1F)。综上所述，作者观察到在儿童原发性AML中circRNA表达的显著差异，支持了研究circRNA在髓系白血病发生中作用的重要性。circRNF220是在广泛的样本验证过程中确定的最佳候选(Fig.1G)。作者发现，与健康对照组相比，原发性AML患者的circRNF220表达持续且显著增加。值得注意的是，circRNF220在小鼠的各种组织中普遍表达，在骨髓、脾和肺等造血组织中高度富集(Fig. 1H)。此外，在作者调查的儿童白血病和其他血液系统疾病(包括ALL、MDS、JMML、CML、ITP、贫血、淋巴瘤和血小板减少症)中，circRNF220在儿童AML中高表达(Fig. 1I)。
急性髓系白血病circRNF220基因的鉴定与验证
接下来，作者验证了circBase数据库和circBank数据库中是否存在circRNF220。基因组结构显示，circRNF220位于1p34.1，含有一个较大的第二外显子(742bp)，该外显子来源于RNF220基因，右侧有较长的内含子(Fig.2A)。为进一步鉴定circRNF220，检测cDNA和gDNA中的线性转录本。PCR结果表明，用不同的引物从cDNA中扩增出环状条带，但不能从gDNA中扩增出环状条带，而从cDNA和gDNA中扩增出环状条带(Fig. 2B)。然后作者研究了circRNF220在原代AML细胞中的稳定性和定位。用转录抑制剂放线菌素D处理后，在指定的时间点收集总RNA。对circRNF220和RNF220 mRNA的分析表明，circRNA亚型非常稳定，转录本的半衰期超过48h，而线性转录本的半衰期为4h (Fig.2C)。QRT-PCR分析RNase R处理的AML细胞中circRNF220和RNF220 mRNA的丰度，证明circRNF220在形式上是圆形的(Fig. 2D)。此外，qRT–PCR分析细胞核和细胞质circRNF220的表达，以及circRNF220的FISH结果表明，circRNF220优先定位于细胞质，当然也有适度的比例定位于细胞核(Fig. 2 E–F)。综上所述，作者的结果表明，circRNF220是一种在儿童AML细胞中表达丰富且稳定的circRNA。
circRNF220在小儿AML中的潜在诊断和预后预测价值
鉴于circRNAs在白血病诊断和治疗中的巨大作用，作者探讨了circRNF220的临床价值。作者首次发现，与健康对照组相比，几乎所有AML亚型(除M6/M7外)患者的circRNF220表达持续且显著增加(Fig. 3A)。根据队列中circRNF220表达的中位数水平，作者将儿童AML患者分为高表达组和低表达组，以确定circRNF220表达是否与临床病理特征相关。然而，现有的病理数据并无显著差异(Table 1)。接下来，作者进行ROC曲线分析，以检验circRNF220表达在AML患者与健康对照和其他血液病患者之间的潜在诊断价值(Fig.3B)。有趣的是，研究结果表明，circRNF220在急性髓系白血病患者的外周血样本中也有明显较高的表达(Fig.3C)。此外，应用ROC曲线分析检测外周血中circRNF220表达的潜在诊断价值(Fig. 3D)。提示无论是骨髓还是外周血中的circRNF220都有相当大的潜力作为诊断生物标志物。为了确定影响AML预后的生物学机制，作者验证了RNF220在不同治疗阶段AML患者中的表达。在新诊断的AML患者中，circRNF220的表达水平明显高于健康对照组(Fig. 3E)。Wilcoxon符号秩检验结果显示，几乎所有配对的CR样本中，circRNF220的表达都显著降低(Fig. 3F)。这些结果证实了circRNF220在AML进展阶段的动态表达，提示其在白血病的发生和复发中可能起着复杂的作用。在对这些患者进行随访后，作者发现在确诊时复发患者的circRNF220表达几乎是其余持续CR患者的2.5倍(Fig. 3G)。作者观察到在诊断时高表达的RNF220患者的RFS率(79.07%)低于低RNF220表达的患者(Fig.3H)。作者得出的结论是，初诊时的circRNF220表达水平是儿童AML患者复发的独立和可靠的预测因子。
circRNF220对人急性髓系白血病细胞增殖的促进作用及对凋亡的影响
接下来，作者试图研究circRNF220对白血病细胞增殖和凋亡的影响。如图所示(Fig.4A), circRNF220过表达显著加速AML细胞增殖。此外，circRNF220的上调显著降低了G0/G1期细胞的百分率，增加了S期和G2/M期细胞的百分率(Fig.4B-C)。值得注意的是，circRNF220的过表达导致更大的核质比和更少的分叶状核，表现出未成熟的外观(Fig.4D)和下调THP-1细胞CD11b和CD14的表达(Fig.4E-F)。通过不同的检测方法观察到急性髓系白血病细胞系的凋亡显著减少(Fig. 4G-I)。有趣的是，原代AML细胞在circRNF220 kD后，Annexin V染色显示细胞总数减少，凋亡迅速(Fig. 4J-K)。这些数据共同表明了circRNF220在急性髓系白血病中的功能相关性。
AML细胞中circRNF220调控的异常转录网络
为了明确circRNF220在AML细胞中的转录功能，作者利用RNA-seq技术分析了3例儿童AML患者在LV-sh-circRNF220感染后原代细胞中的基因表达。共有107个mRNA(62个下调，45个上调)在所有三个样本(Fig. 5A-B)。为了确定circRNF220调控的分子途径，作者对常见的异常转录本进行了KEGG分析。作者观察到与细胞凋亡、溶酶体和急性髓系白血病相关的基因正向富集(Fig. 5C)。作者还应用GSEA来识别由circRNF220缺失而产生的不同调节通路，并发现所有三名AML患者共有的几条GSEA通路在统计学上显著失调。参与发育的凋亡过程也有显著的P值和归一化富集分数1.34(Fig. 5D)。作者在AML-E697细胞中独立评估了几个凋亡相关基因(Fig. 5E)。发现AKT、XIAP、ARF1、BAG5等抑制凋亡基因的表达明显下调，促凋亡基因BIM表达上调(Fig.5F)。值得注意的是，作者还显示，造血功能的标准富集分数为-1.26 (Fig.5G)。然后作者想知道在AML复发过程中，circRNF220是否与克隆群体的丰富或维持有关，通过对文献的系统回顾，作者调查了与AML复发相关的一个潜在的基因图谱。作者从作者的转录组数据中验证了HL-60过表达系统中与复发有关的差异表达基因 (Fig. 5H-I)。综上所述，这些数据表明，circRNF220在细胞凋亡和AML复发中起着重要作用。
circRNF220可以吸附miR-30a
由于circRNAs通常通过与miRNAs相互作用发挥作用，因此作者寻找与circRNF220相互作用的候选miRNAs。通过计算预测，作者确定了5个候选者(miR-30a/b/c/d/e)。它们的预测结合位点位于circRNF220中高度保守的AGO-binding位点内(Fig. 6A)。利用作者队列中的一个子集(n=36)的miRNA表达数据，作者分析了这些miRNA和circRNF220表达之间的相关性。只有一种miRNA miR-30a的表达与circRNF220的表达显著相关.(Fig. 6B) 正如预期的那样，circRNF220kD增加了AML细胞中miR30a的丰度(Fig. 6C) 随后，作者进行了RNA下拉实验，观察到miR-30a在原代AML细胞和AML细胞系中显著富集 (Fig.6D)。然后作者增强miR-30a的表达，发现miR-30a 的过表达在AML细胞中与阴性对照细胞相比显著降低了癌基因EKL3和IER2的丰度(Fig. 6E)。与miR-30a在RNF220kD附近上调一致，ELK3和IER2的丰度显著降低 (Fig. 6F)。同样，除BIM外，其他靶基因，如GLUD2和MYSM1，在miR-30a OE细胞和circRNF220 kD细胞中均下调。(Fig. 6E-F) 接下来，作者应用GSEA找出了受circRNF220抑制的不同调控通路，发现miR-30靶分子显著下调，这与上面的发现是一致的(Fig. 6G)。为了解AML患者中circRNF220和miR-30a靶基因之间的关系，作者发现ELK3、IER2、GLUD2和MYSM1在初发AML患者和复发患者的评估样本中的相对丰度始终高于CR患者和健康对照组的样本(Fig. 6H)。此外，miR-30a的OE可显著抑制由增强circRNF220表达所诱导的HL-60和K562细胞的增殖(Fig. 6I-J)。重要的是，经miR-30a处理的HL-60细胞有明显的凋亡迹象，并且通过转染miR-30a可以恢复由circRNF220的OE诱导的HL-60细胞凋亡的显著增加(Fig. 6K)。综上所述，这些数据表明，circRNF220可能作为内源性miR-30a海绵隔离miR-30a并抑制其活性，从而导致其下游靶标水平的增加，包括MYSM1和IER2。
全文小结：
作者发现了一种circRNA，circRNF220，它在AML患儿的外周血和骨髓中特异性地丰富和积累，具有较高的敏感性和特异性。值得注意的是，CircRNF220的表达独立预测预后，而circRNF220的高表达是复发的不良预后标志。从机制上讲，circRNF220可能作为miR-30a的内源性吸附海绵，隔离miR-30a并抑制其活性，从而增加其靶基因MYSM1和IER2的表达，参与AML的复发。综上所述，我们可将circRNF220作为一种潜在有效的AML生物标志物和治疗靶点进行研究。感兴趣的小伙伴可以试一下呦~
更多精彩文献 生信人 公众号每日更新