- 原文：Mini review: Challenges of metabolomics in human gut microbiota research
- DOI：https://doi.org/10.1016/j.ijmm.2016.03.006
image.png
摘要：
- 该评论强调了代谢组学在研究人类肠道微生物代谢中的作用。我们肠道中的微生物群落发挥着多种功能，对人类健康和疾病产生巨大影响。在元组学学科中，肠道微生物组是由（宏）基因组学，（宏）转录组学，（宏）蛋白质组学和代谢组学研究的。应用于粪便样品的代谢组学研究的目标是进行代谢谱分析，量化感兴趣的化合物和类别，表征肠道微生物产生的小分子。核磁共振波谱法和质谱法是粪便代谢组学中应用的主要技术。代谢组学研究已越来越多地用于与肠道菌群有关的有关健康和疾病的研究，其主要重点是了解炎症性肠病。这篇综述总结了该领域中已阐明的代谢物。我们还解决了代谢组学在当前和未来肠道菌群研究中的主要挑战。第一个挑战反映了对适当分析工具和管道的需求，包括样品处理，适当设备的选择和统计评估，以实现有意义的生物学解释。第二个挑战与选择合适的动物模型进行肠道菌群研究有关。我们以核磁共振光谱为例，研究了粪便代谢产物谱的种间比较。最后，我们提出了人类肠道菌群和代谢组变异性的问题，这对个性化营养和医学的概念具有重要影响。
关键词：代谢组学；肠道菌群；质谱法NMR； IBD
1. 引言
- 肠道菌群在人类健康和疾病中起着至关重要的作用。啮齿类动物的转化研究表明，肠道菌群可以参与不同的生理功能，例如能量收集，肠道功能的塑造和维持或宿主免疫系统的调节。此外，微生物的组成可以影响宿主对病原体的反应以及对疾病的易感性。由于肠道中的微生物拥有自己的基因组，因此它们会经历相同的转录，翻译和代谢机制，如图1A所示。为了进行人类肠道菌群的研究，应该理想地利用通过粘膜活检获得的样本。但是，由于与相应采样程序有关的挑战，主要收集粪便样品。尽管粪便微生物群只能部分代表肠道菌群，但粪便基因组，转录组，蛋白质组和代谢组可潜在地用于定义肠道微生物生态系统中的特定成员，并通过解释基因表达模式以及蛋白质和代谢产物的行为来研究其功能。大型“组学”研究是单独进行或以集成方式进行的，以便对动态系统中发生的过程进行全面概述（图1B）。有关复杂微生物群落及其在生境中相互作用的Omics研究，例如在人的肠道中，常常带有前缀“元”，例如宏基因组学，元转录组学，元蛋白质组学或（宏）代谢组学，后者在文献中很少使用。几项研究试图将这些技术结合起来，或将其整合到不同级别的数据处理和评估中，从而不仅限于分类学分析。
图1：
-
有关研究人类肠道微生物群功能特性的宏-组学概述。（A）人体肠道菌群拥有自己的基因组，转录组，蛋白质组和代谢组，可以独立研究或与其他组学学科结合进行研究。（B）宏基因组学，宏转录组学，宏蛋白质组学和代谢组学的现有领域，并有一些典型代表。（C）从2000年开始，代谢组学领域的兴起是通过每年发表的文献数量来表示的。（D）粪便代谢组学一直在研究与微生物群，疾病，健康和饮食有关的主题，每个主题找到的出版物数量。与疾病有关的问题进一步由八个不同的疾病类别代表。
image.png
- 代谢组学的定义是对生物系统中所有代谢物的鉴定和定量进行全面分析。为了进行代谢组学研究，已应用了光谱学或光谱技术。为了监测来自宿主，微生物及其共代谢的代谢物，已对包括尿液，血浆，粪便或活组织检查物在内的各种生物基质进行了分析。粪便中的代谢组学研究肠道微生物代谢只是一个新兴但有希望的领域，因为粪便是一种易于获取且无创的基质，其代谢产物来自宿主，肠道微生物群和食物成分。To obtain a quick overview of the published literature on studying microbial ecosystem using fecal samples via metagenomics, metaproteomics, metatranscriptomics, or metabolomics, an ISI Web of Science search was conducted using the following queries: TOPIC: (fec hum metabolom(or nom))* for human fecal metabolomics; TOPIC: (fec hum metatranscriptom)* for human fecal metatranscriptomics; TOPIC: (fec hum metagenom)* for human fecal metagenomics; TOPIC: (fec hum metaproteom)for human fecal metaproteomics; TOPIC: (fec hum 16S sequencing)* for 16S sequencing of genome present in human fecal samples. 除了16S测序，宏基因组学的组学领域出版物数量最多，其次是代谢组学，而关于转录组学和元蛋白质组学的出版物则相对较少（图1C）。尽管它们很普遍，但在一定时间点后，代谢组学，宏基因组学或16S测序的趋势却有所下降（图1C）。关于使用粪便样品进行代谢组学研究的大多数出版物都集中在微生物群，健康，与疾病相关的问题和饮食方面（图1D）。反过来，与疾病相关的问题主要集中在炎症性肠病，癌症，感染和肥胖症上（图1D）。
2. 粪便代谢组学与炎症性肠病
- 炎症性肠病（IBD）被发现是与代谢组学研究和肠道菌群有关的主要疾病之一（图1）。IBD是一种主要影响胃肠道的特发性疾病。溃疡性结肠炎（UC）和克罗恩氏病（CD）这两种主要形式具有复杂的病因。与IBD有关的共生菌群失衡被讨论，多样性降低，元基因组和元蛋白质组改变。例如，IBD患者的Faecalibacterium prausnitzii是人类肠道中最重要的短链脂肪酸（SCFA）产生者，其含量降低了，这表明细菌和细菌之间的联系。代谢产物。为了获得由非靶向代谢组学揭示的IBD患者代谢物改变的概述，表1中列出了相应的数据。总共有9项研究涉及人并研究了与IBD相关的代谢物。上面提到的两项研究没有描述可区分的代谢产物，而是利用代谢组学作为分类/验证工具。核磁共振（NMR）光谱，气相色谱和液相色谱与质谱联用（分别为GC / MS和LC / MS）和直接注入（DI）傅里叶变换离子回旋加速器质谱（FT-ICR-MS）用于分析代谢产物（表1）。表1总结了描述并显示在对照和IBD患者之间有显着改变的所有化合物（分类为UC和CD）以及其各自的人体代谢物数据库（HMDB）条目。Ahmed等人（2013年）的研究描述了IBD患者发生的许多代谢物改变，使用GC / MS测定粪便中挥发性代谢物，FT-ICR-MS测定分子量极性分子。IBD最具区别性的代谢产物主要来自NMR研究（总共3种），是丙氨酸，异亮氨酸，亮氨酸，赖氨酸，缬氨酸，苯丙氨酸和丁酸酯。使用MS平台在IBD相关研究中描述的代谢物多种多样，但长链脂肪酸似乎在疾病中起重要作用。我们必须指出，经常被报道参与IBD的代谢模式可能更具特异性，而不是原因是炎症或肠道菌群改变所致。IBD患者粪便样品中氨基酸的增加被解释为营养不良，因为发炎的肠组织对营养的吸收很低。
表1.据报道与炎症性肠病有关的代谢物的摘要（根据克罗恩病或溃疡性结肠炎的形式分类）。
image.png
image.png
- 举一个特定代谢物的例子，在代谢组学研究中描述的所有化合物中，丁酸已显示与细菌代谢高度相关。丁酸盐是一种严格的微生物代谢产物，源于细菌发酵产生的不可消化的碳水化合物的降解。F. prausnitzii不是人类肠道中唯一产生丁酸的物种。其他主要的丁酸盐生产者主要来源于门扇菌，包括Roseburia属细菌，梭状芽胞杆菌属XIVa内的真细菌，梭状芽胞杆菌属IV内的普氏假丝酵母。根据丁酰辅酶A：乙酸酯辅酶A转移酶序列，直肠大肠杆菌被证明是人类受试者的主要居所。丁酸盐在结肠腔中吸收，并用作结肠细胞的能量来源。由于每个物种都可能参与这种代谢产物的生产，因此很难得出哪种细菌会积极参与丁酸的形成。一种可能性涉及随后的绝对丁酸酯浓度的测量（实际上在表1汇总的代谢组学研究中未报告），并观察丁酰辅酶A：乙酸酯辅酶A转移酶的模式（例如在基因调控水平，mRNA表达水平上）（或酶促活性），以得出丁酸盐浓度与其活性生产者之间的联系，以进一步质疑其在疾病中的作用。
- 为了使来自不同代谢组学实验的结果更具可比性，重要的是对相应的代谢物进行进一步的定量分析。测量人体肠道微生物代谢的另一种有前途的方法是结合和整合不同的技术，而不是只关注一种方法。例如，Shoaie等人（2015年）结合了NMR和GC / MS代谢组学方法，以定量人类粪便样品，血浆样品和细菌上清液中的氨基酸和SCFA。但是，在IBD中并未进行此类分析。到目前为止，有关IBD的研究已将NMR或MS技术应用于代谢组学分析，这先验地定义了您要查看的代谢物。
3.粪便代谢组学分析中的分析挑战
- 检测成千上万种具有多种化学极性的代谢物是一项艰巨的任务。建立在不同分析平台集成基础上的完善工作流程是此任务的关键。由于其高度的化学多样性和复杂性，需要相对于研究目标仔细对待生物样品。样品采集，样品制备以及选择适当的分析工具是鲁棒的样品处理的基本要求。在这篇综述中，描述了一般代谢物分析工作流程的某些方面，包括精确的研究设计，样品处理，仪器设置以及数据分析，以及作为最终目标的生物学解释结果和数据整合（图2）。
图2
-
从样品收集到生物学解释的代谢组学分析工作流程。缩写：SPE =固相萃取，SPME =固相微萃取，LC =液相色谱，GC =气相色谱，CE =毛细管电泳，MS =质谱，ESI =电喷雾电离，APCI =大气压化学电离，MALDI =基质辅助激光解吸/电离，Q =四极，QQQ =三重四极，ToF =飞行时间，FT-ICR =傅里叶变换离子回旋共振，NMR =核磁共振，COSY =相关光谱，HSQC =异核单量子相干，NOESY =核Overhauser效应光谱。
image.png
- 代谢组学可细分为两种不同类型的分析：目标分析和非目标发现导向分析（即代谢物/代谢谱分析）。目标方法是指分析特定类别的化合物，例如氨基酸，脂肪酸，脂质，碳水化合物或胆汁酸。非目标分析的定义是通过使用能够描述大量代谢物的技术来快速，全局地概述样品的代谢多样性。以下部分描述了进行靶向和非靶向代谢组分析所必需的样品（预处理）和分析技术。
3.1 样品收集，存储和准备
- 在代谢组学领域，适当的样品收集和储存条件以及适当的样品制备非常重要。DNA测序和代谢组学分析所必需的人类粪便样品被收集在专用试管中，并在样品制备之前通常储存在−80°C至−20°C的范围内。样品存储是至关重要的且敏感的步骤。需要最小化冻融循环以防止可能的代谢物降解。例如，Comstock等人，2001年研究了血浆和血清的连续冷冻和解冻如何影响胆固醇，微量营养素和激素的浓度。结果表明，在3个冻融循环中未观察到上述代谢物的浓度变化。对于某些激素（雌酮，雌二醇，睾丸激素和与性激素结合的球蛋白），可以观察到一些浓度变化，但效果相对较小。但是，在6-10个周期后，某些代谢产物受到中等程度的影响。Pinto等人，2014年报道了人体血浆中脂质，丙酮，胆碱化合物，丙氨酸，葡萄糖和丙酮酸的变化，随后在4个冻融周期内变化。Gautam等人，2014年提出了查尔酮衍生物S001-469在大鼠血浆，尿液和粪便中经过3次冻融循环后的稳定性。Pappano等人（2010年）测试了多达4个冻融循环的明胶粪便样品中的激素含量。直到3个周期，激素含量均未观察到变化，仅在第4个周期后才显着增加。
- 选择一种提取方法非常具有挑战性，取决于分析的目的和分析技术的选择。此外，该步骤对于获得良好的代谢物提取率至关重要，即获得最大数量的可量化代谢物，同时防止其可能的物理和化学变化。最重要的是，为了终止样品中的新陈代谢，不可立即淬灭，并且可以通过突然改变pH或温度来实现。淬灭方法包括添加冷甲醇，液氮，高氯酸或硝酸。通常，极性代谢物用纯有机溶剂（例如甲醇）或溶剂混合物（例如甲醇-水）萃取。为了提取亲脂性代谢物，通常使用非极性溶剂，例如氯仿或己烷。Walker等。（2014a）在她的涉及糖尿病小鼠粪便样品的研究中表明，在使用DI FT-ICR-MS进行非目标代谢组学实验的四种不同提取方法中，通过甲醇提取实现了最高量的观察到的代谢物。Cao等人，2011年研究了甲醇提取的肝硬化和肝细胞癌患者的粪便样本。Gao 2009在人体粪便水上测试了三种不同的萃取溶剂，发现去离子水是通过GC / MS分析代谢产物的最佳选择，尤其是用于观察与脂肪和氨基酸对应的信号时。对于代谢组分析，需要确保去除蛋白质。可以通过离心制备的包含粪便样品和所选溶剂的混合物来实现。如果需要，可以将收集的上清液稀释，然后注入所选的分析系统中。
- 有时有必要在提取过程之后将样品浓缩，因为少量的代谢物可以在相对大量的提取溶剂中稀释。浓缩样品的方法包括例如在真空下蒸发溶剂或冷冻干燥以从水溶液中除去水（即冻干）。固相萃取（SPE）或固相微萃取（SPME）是另一种用于浓缩样品的技术，但由于某些特定种类化合物的萃取取决于SPE捕集材料，因此仅限于某些代谢产物。对于目标分析，需要根据目标化合物的类型调整提取方法。Müller等人（2014年）使用包含人尿，血浆和血清以及小鼠盲肠含量的生物样品，通过超高效液相色谱/质谱（UHPLC / MS）分析了d-氨基酸。用甲醇提取代谢物，然后用邻苯二甲醛/异丁酰基-1-半胱氨酸试剂（OPA / IBLC）进一步衍生。Cai等，2012和Humbert等，2012均报道了从粪便中提取胆汁酸的方法，而Humbert等。测试了四种不同的提取方法来分析胆汁酸。他们表明，用异丁酰基-1-半胱氨酸提取是测量粪便样品中胆汁酸的最有效方法。对于挥发性脂肪酸，使用6％磷酸水溶液（1：2 m / V）进行萃取，并通过顶空GC / MS分析所得混合物。
3.2 人粪便样品分析
- 在过去的几十年中，将MS应用于生物样品的代谢组学分析的兴趣有所增加，除NMR外，如今已成为相应研究中最重要的分析方法。以下部分描述了产生带电分子所需的几种电离技术。还介绍了可以与质量分析仪结合使用的分离技术。
- MS分析可通过直接输注或结合在线分离技术（例如气相色谱，毛细管电泳或液相色谱。基于研究目的和/或目标化合物，需要选择正确的电离技术。电喷雾电离（ESI）是使极性和离子化合物电离的最常用技术，而大气压化学电离（APCI）用于使极性较小和中性的分子电离（Villas-Boas等，2005）。代谢组学中通常使用几种类型的质量分析器，每种类型的质量分析器在准确性，灵敏度，特异性和分辨率方面都有其自身的局限性：离子阱，单（Q）和三（QQQ）四极质谱仪，飞行时间（ToF））质谱仪，orbitrap，傅立叶变换离子回旋共振质谱仪。质谱仪通常包括四极杆碰撞池，以选择特定m / z值的离子进行进一步分析（例如MS / MS）。DI MS推荐用于涉及大量样品的高通量研究，并且具有分析时间短的优点。DI ESI FT-ICR-MS在代谢组分析中的应用提供了高分辨率和高质量准确度，可同时检测成千上万种代谢物（Forcisi等人，2015）。它既可以用作针对性方法，也可以用作非针对性方法。仪器的高质量精度使我们能够将元素组成分配给与质量峰相对应的m / z值。将MS与LC系统耦合提供了一种可能性，可以分别分析复杂生物基质中的极性，非极性以及中性化合物。LC / MS系统中常用的电离技术是ESI或APCI，适用于广泛的质量范围。由于LC / MS的分辨力，灵敏度，特异性以及从保留时间（RT）域中提取有关分析代谢物的其他信息的可能性，因此它是一项出色的技术（Forcisi等人，2015）。液相色谱方法的两个主要分支，通常与质谱分析结合使用，包括高效液相色谱法和超高效液相色谱法（分别为HPLC和UHPLC）。UHPLC优于HPLC的优点是分析时间更短，分离度更高，效率和灵敏度更高，并且减少了分析所需的样品和溶剂量。GC / MS是另一种偶联，因其分离效率而广泛用于代谢组学分析。但是，这种方法的使用仅限于挥发性化合物，因此，通常需要由代谢物衍生化（例如，通过甲硅烷基化或烷基化/酯化）组成的额外制备步骤（Villas-Boas等，2005）。用于GC / MS的质量分析仪的选择取决于所需的质量精度水平，常用的系统包括与Q-或ToF-MS结合使用。LC / MSn的广泛应用，不仅提供了有关单同位素质量的信息，而且提供了有关代谢物结构的一些提示，从而有机会在复杂样品中鉴定目标代谢物。可以应用几种MSn模式，例如产物离子扫描，前体离子扫描，中性损失扫描和多反应监测（MRM）。在前体扫描中，选定的目标离子与碰撞池中的惰性气体（例如Ar或N2）碰撞（即碰撞引起的离解），并产生产物离子，这些离子负责在样品中形成特征性的碎片图谱。频谱。Walker等人（2014a）应用了数据依赖的MS / MS方法（基于自动模式中选定前体的碎片化），使用UHPLC Q-ToF-MS系统鉴定糖尿病小鼠粪便中的牛磺酸和硫酸盐共轭脂肪酸。研究粪便代谢组学的实例包括应用非靶向代谢组学来区分母乳喂养婴儿和配方奶喂养婴儿，并使用GC / MS和LC / MS / MS分析来鉴定由于体外分批培养发酵而引起的各种变化的代谢产物。
3.3 数据处理和统计评估
- 最近发表的评论列出了处理代谢组学研究数据的最常用平台，这些平台根据分析类型（例如，预处理，统计解释，网络分析）或使用的分析技术类型（例如，LC / MS，GC /MS，NMR，MS / MS）。数据分析和解释在很大程度上取决于预处理，而预处理又可能成为最耗时的步骤。需要仔细计划，有时取决于所使用的分析技术。这一步对于代谢组学研究产生的数据集可能是非常具有挑战性的，因为样品中检测到大量不同的代谢产物。预处理包括数据过滤（例如消除化学和仪器噪声），校准，光谱对齐以生成数据矩阵，归一化（即影响样品）和缩放（即影响特征）。进行这些操作可确保样品之间的可比性，并可以确定样品集中代谢物浓度的差异。如van den Berg等人在2006年中详细描述的，常用的缩放方法是pareto缩放，自动缩放和大规模缩放。应该指出的是，由于预处理涉及二维或二维，因此处理LC / MS数据非常棘手。在相同的实验设置中，相应的数据通常具有保留时间漂移以及峰强度漂移效应，这两者都可能导致错误的统计结果。因此，如Misra和van der Hooft，2016中所述，建议进行保留时间校准和强度漂移校正。
- 在对数据进行预处理之后，可以使用几种统计工具来发现样本集中的区别特征（Worley和Powers，2013）。数据分析涉及应用具有参数性质（例如学生t检验，多元线性回归）或非参数性质（例如曼-惠特尼检验，随机森林）的不同单变量和多元方法。这些方法还可以分为无监督技术（即，不将样品标签包括在计算中的方法，例如主成分分析（PCA），层次聚类分析（HCA））和监督技术（即，其中的计算涉及有关以下信息的方法）样本标签，例如线性判别分析（LDA），k最近邻（kNN））。有监督的多元技术，偏最小二乘判别分析（PLS-DA）已被证明是在代谢组学研究中特别有用的工具。由于其简单性和识别潜在生物标志物的能力，因此经常使用。然而，代谢组学领域具有开发和应用新的有价值的统计和计算方法的巨大能力。尽管基于MS的非靶向代谢组学是对生物系统内所有小分子代谢物进行全局筛选的有力工具，但鉴定光谱中存在的代谢物信号仍是关键挑战之一。通过在化合物数据库和光谱数据库，METLIN或ChemSpider等化合物数据库中找到匹配项，可以部分完成此任务。为了更生动地描述生物系统，经常使用代谢途径数据库，例如KEGG或MetaCyc。为了简化和优化注释谱峰作为潜在代谢产物并将鉴定出的化合物映射到代谢途径的任务，开发了MassTRIX Web服务器。然而，即使在数据库搜索后，仍然可能未知负责表型分类的大量代谢物。如前所述，FT-ICR-MS的超高质量精确度允许将推定的化学式分配给光谱峰。因此，可以建立代谢物对之间的联系，因为它们可能与明确定义的质量差异相关。基于实际生物化学转化的重构网络能够创建有关生物系统行为的假设，并能更精确地归因于推定公式，因为随着代谢物离子的m / z值增加，通过简单组合方法进行正确赋值的能力会降低。这个想法得到了进一步发展，并应用于其他研究。在反相UHPLC离线结合FT-ICR-MS的实验中也显示了这一点，FT-ICR-MS会根据其保留时间在重构网络簇中代谢。由此，对应于未知代谢物的信号不仅被赋予化学式，而且可以就其生物学功能而被上下文化。对于通过UHPLC结合ToF-MS获得的数据也采用质量差异网络进行公式分配的策略，该数据的准确性低于FT-ICR-MS。结果表明，通过LC分离异构体的注释是可能的，并且网络中代谢物的排列清楚地显示了RT依赖性模式。这些发现为代谢物鉴定开辟了新的前景，因为可以从网络分析中检索出许多信息，其中代谢物的位置与其性质相对应（图3）。
图3
通过分析质量差异网络来分解代谢物结构，其中通过融合DI FT-ICR-MS和LC / MS获得的数据对代谢物的结构信息进行编码。网络可以包括来自数据库或统计分析的其他信息。
image.png
4.核磁共振波谱法研究粪便代谢产物谱的空间肠道差异和种间比较
- NMR光谱通常受益于最少的样品制备和代谢物间的抑制作用，这使得能够并行研究不同的样品基质和分析的定量性质。然而，该技术的一个缺点在于代谢物检测的灵敏度相对较低，这只能通过使用高磁场磁体和低温探针来部分克服。另一个缺点是来自不同代谢物的信号重叠，可以通过采集二维实验来解决。与诸如血浆和尿液之类的生物流体相比，无需提取并且添加缓冲液就足够了，而分析粪便或肠腔中的内含物则需要去除未消化的物质，死细菌和其他固体颗粒。尽管质谱分析使用各种提取方法，如前一章所述，但用于NMR采集的粪便提取物主要是用水或甲醇制备的。水提取物集中在小的亲水性分子上，例如氨基酸，葡萄糖，甘油，三甲胺。甲醇提取的重点是亲脂性物质，例如脂质，胆酸盐，小酚酸和N-乙酰基化合物。两种提取物中均可检测到SCFA和胆汁酸（Jacobs等，2008）。但是，由于脂质的提取会导致甲醇提取物中大部分NMR谱图之间出现大量信号重叠，因此通常选择含水提取物。Lamichhane等人，2015年研究了样品与萃取溶剂的比例和超声处理对代谢物谱的影响，并得出了粪便重量与溶剂体积比为1：2的最佳回收率和重现性。即使降低了代谢产物在缓冲溶液中的稀释率，但通常不建议冻干，因为冻干可能会导致挥发性代谢产物流失（Saric等，2008）。代谢物提取后，将含有磷酸盐缓冲液（pH 7.4）锁定物质D2O和内标3-（三甲基甲硅烷基）丙酸-d4钠盐（TSP）的NMR缓冲溶液添加到粪便水提取物中。
- 为了获得样品中代谢物的概况，通常使用包括水预饱和的标准脉冲序列获取一维NMR光谱，以抑制来自水分子的信号。通过将化学位移与化学数据库，中可用的信息进行比较，可以实现代谢物的鉴定。此外，代谢物分配还需要一系列2D NMR光谱。此外，二维实验提供了大大减少的信号重叠，因此增加了样品中阐明的代谢物的数量。这里需要权衡的是需要增加采集时间并需要对信号强度进行量化的其他考虑因素，而一维实验的光谱可以直接提交给多元统计检查以进行非目标分析或所选共振的整合可用于目标分析（Lamichhane等，2014； Michail等，2015）。该领域的进一步发展正在进行中，例如2D 1H-13 C-HSQC NMR非线性采样方法的应用，可以快速获取定量数据。为了更详细地了解微生物代谢，代谢通量分析提供了微生物对底物的使用和最终产物生成的见解。
- 对粪便代谢组的影响是多种多样的。大多数研究都是在啮齿动物模型中进行的，旨在表征和量化年龄的贡献，药物管理以及不同疾病的代谢描述。迄今为止，人类研究仅限于癌症，乳糜泻，非酒精性脂肪肝等不同疾病。溃疡性结肠炎和克罗恩氏病，以及饮食对粪便代谢组的影响。食品，例如奶酪和牛奶，以及特定的饮食成分,例如聚葡萄糖纤维，饮食中的葡萄糖苷，与食物相关的致癌物。果聚糖和葡萄汁提取物在粪便的代谢产物上产生痕迹，可用于食品生物标志物的检测，从而支持对有益生物的讨论。或对宿主的不利影响。从居住类型，地理起源（Yatsunenko等人，2012）和季节差异（Gomez等人）的角度来看，饮食影响在考察人类和灵长类动物的微生物群组成时也可能起着重要作用。在胃肠道内，观察到粘液和管腔之间的微生物群组成差异（Turnbaugh等，2009），以及从盲肠到结肠和粪便的纵向差异（Eckburg等，2005）。Lavelle等人，2015年和Zhang等人，2014年报道了结肠和远端肠道（包括回肠）不同区域中不同细菌的空间变化，而检测到的变化中的很大一部分是由于志愿者之间的细菌装配不同。我们已经报道了小鼠肠腔内代谢产物的空间变化，这些空间变化直接与盲肠中的碳水化合物和蛋白质的微生物分解以及结肠的再吸收过程有关，这一发现也在肠道中被发现。组织（Martin et al。，2009）。这种代谢变化受微生物群的影响，但也可能直接促进肠道内所选细菌生长的反馈，并触发微生物组和宿主的信号传导途径（Delzenne等，2011）。比较来自不同动物和人类的尿液，其总体外观与其他物种中未出现的许多代谢物非常不同。粪便中的终产物在很大程度上具有可比性：SCFA是难消化的碳水化合物发酵的产物，氨基酸，蛋白质和氨基酸的发酵产物（例如5-氨基戊酸酯，苯酚，尸胺，腐胺），脂质氧化的发酵产物（例如支链）脂肪酸，简单的碳水化合物，胆碱代谢物和乙醇。但是，比较不同代谢物的总量，可以发现明显的差异（图4）。
图4
-
来自小鼠和人类的粪便水提取物的1D 1H代谢产物概况和2D 1H-13C-HSQC代谢产物概况概述。（A，B）代谢物（例如SCFA）的1D NMR概述，用于定量比较具有较高SCFA和人类样品中许多氨基酸的物种。光谱归一化（总面积和概率商归一化）检索到一致的结果。（C）2D NMR分析减少了代谢物的重叠，并描述了小鼠（黑色）和人（红色）2D粪便谱之间是否存在差异。区分这两个光谱的代谢物标记为蓝色（小鼠）和红色（人），例如人类粪便中的mHPP和小鼠粪便中的高分子量大分子。缩写：但是=丁酸酯，丙=丙酸酯，mHPP = 3-羟苯基丙酸酯，DMA =二甲胺，BCAA =支链氨基酸，美国。=未分配，Leu =亮氨酸，Val =缬氨酸，Ile =异亮氨酸，C5 / C6-FA = C5 / C6-脂肪酸，TMA =三甲胺，Thr =苏氨酸。*根据脂质和蛋白质推测为大分子背景。（要解释此图例中对颜色的引用，请参阅本文的网络版本。）
image.png
- 人和小鼠之间SCFA和氨基酸的浓度不同（图4A和4B）。此外，人的粪便谱显示出较高的葡萄糖水平，不同糖的较大变化和大量的胆碱代谢产物。柠檬酸循环代谢产物富马酸盐和苹果酸也仅在人的概况中可见。食品腐败产品，例如3-羟丙酸丙酯（mHPP）的出现证明多酚的消化是高度饮食依赖性的（Rechner et al。，2004），仅在人类中观察到（图3C）。另一方面，小鼠的粪便中排泄出更多的胆汁酸，显然还有更多的大分子（据信分配给脂质和蛋白质），这表明与人类相比，宿主难消化物质的发酵较不完全。尤其是SCFA和氨基酸的浓度可以使肠道细菌的丰度与功能特性之间建立联系。因此，啮齿动物模型研究对人类健康和疾病的可翻译性受到限制。尽管动物模型提供了强大的工具来研究代谢途径的原理以及宿主与微生物群之间的相互作用，但在肠道生理，免疫学和营养学上，转向与人类更接近的动物模型至关重要。猪被认为是出色的非灵长类动物模型，尤其是在肠道生理和杂食性饮食方面。尽管较高的动物住房成本导致样本量减少和转基因模型的可用性降低，但使用猪提供了对更大的生物流体和组织量进行采样的可能性，并允许对肠腔进行侵入性研究，以追踪宿主与微生物群之间在营养方面的复杂相互作用。干预和疾病病因，同时限制了人类普遍观察到的巨大变异和外来影响。
5. 人类肠道菌群和代谢表型的多样性
- 考虑到在细胞内外都行使其功能的大量分子，人类生物的生物学复杂性是巨大的。此外，大约70％的细胞代表主要居住在我们肠道的各种共生细菌。这一事实强调了在开发个性化治疗的背景下人类个性化的重要性，这种治疗将侧重于预测和预防医学而不是症状学。由于系统生物学工具和技术的进步，这种发展变得可能。
- 由于人类肠道菌群组成及其动力学与宿主代谢之间的持续相互作用，因此引起了人们的极大关注。最近的研究表明，肠道菌群和代谢组中都存在个体特异性模式，随着时间的推移它们可能相对稳定，这说明了理解上述相互作用的重要性在一个主题之内。尽管有可能证据表明肠道中存在共同的微生物核心，但个体间差异似乎比个体内差异大得多，这表明该生态系统具有功能冗余性。受试者之间的多样性及其稳定性可以通过多种原因来解释，例如遗传力，遗传学，饮食，生活方式，环境，微生物群落的复原力。所选分类标准的规模也会影响时间稳定性的结果，该时间稳定性会从门类级别降低到物种级别。当成年期观察到最稳定的状态时，由于肠道菌群的组成与宿主年龄之间的联系而产生了额外的困难。值得注意的是，肠道生态系统的纵向稳定性不仅可以在组成水平上看到，而且可以在基因组水平上看到。这意味着系统发育上不相关的分类单元可能具有相似的功能，潜在的宿主生理状态可能与功能成分而不是组成相关。
- 代谢组学研究中不同变异来源的估计表明，在规划具有纵向或交叉研究设计的实验时应格外注意。对尿液人类样品进行的基于NMR的非靶向代谢组学实验表明，属于同一受试者的数据点明显聚集。应该指出的是，在Assfalg等人的工作中。（2008）的采样是在3个月的时间内进行的，只有12种代谢物足以识别供体。Bernini等。（2009年）报道了即使观察到某些明显受到肠道菌群影响的代谢产物突然或单调变化，人类尿液代谢组的最高三年相对稳定性。一项对血液样本进行的质谱研究显示，即使在初次采样后的7年内，个体代谢表型的持久性也依然存在。高度保守的代谢物是造成这种行为的主要原因（Yousri等，2014）。这些代谢物的长期稳定性与其遗传力显着相关。此外，结果表明，大多数保守的代谢物均属于雄甾酮途径，这表明性别是随时间推移保留独特的代谢表型的因素之一。在涉及粪便样品的代谢组学研究中，也观察到了与不同个体相对应的数据点的聚类，但与微生物数据相比，后者显示了更好的受试者分离。
- 从我们当前的研究中获得的结果可能支持个体中肠道菌群的稳定组成和代谢表型的其他信息，其目的是研究全谷物饮食对肠道微生物生态学和代谢组学的影响。交叉研究设计包括14个星期（Martinez等人，2013a），并包括对应于不同饮食的4个时间点。在基线和每个治疗期结束时收集粪便和血浆样品。除了上述出版物中描述的微生物分析外，还通过DI FT-ICR-MS通过非目标代谢组学分析研究了粪便和血浆样品。对齐获取的光谱，并对所得数据矩阵进行多元统计分析。通过对与操作分类单位计数和粪便代谢组相对应的数据进行层次聚类分析获得的初步结果表明，与同一个体相关的叶子倾向于聚集成在一起（图5）。这些结果强调了这样的想法，即与粪便微生物群和代谢组相对应的某些特征可以随着时间的流逝而保留下来，并有助于受试者的表型化。血浆样品未观察到这样的图片作为主要结果，提示需要进行更深入的分析。揭示个体内肠道菌群组成与代谢表型之间的联系可能有助于进一步了解导致相似功能的内在过程。受我们的发现启发，我们目前专注于寻找单个微生物群与相应代谢表型之间的联系。
图5
-
通过使用欧几里德距离度量和Ward方法对与（A）粪便微生物群相对应的数据集进行层次聚类分析而获得的结果；（二）粪便代谢组。两个大写字母编码一个主题。数字代表完成采样的星期。
image.png 人类有机物的变异性和复杂性导致在个体和人群水平上的不同反应，而系统生物学的最新进展可以帮助克服这些困难，从而导致个性化治疗的发展。这可以被视为现代医学的关键目标，因为每个人对相同的治疗干预措施都有单独的反应。与代谢表型相关的肠道菌群组成的检查可以作为宿主当前状况的指纹，以促进疾病的预防，诊断和治疗。
6. 展望
- 基因组时代标志着一项发现，即每个人都可以通过基因组中编码的信息进行唯一识别。随着技术的飞速发展，尤其是在组学研究中，已经显示出可以在人类肠道微生物群组成和人类代谢组水平上观察到这种独特性（与基因组相比，其可靠性不强）。但是，作为一个人口，我们大多数人对某些刺激的反应相似，这意味着存在稳定的功能和动态模式，其干扰会导致疾病。也许，在某种程度上，研究应该注意信号的可变性较小的部分，以揭示疾病的潜在生物标记，尽管个性化方法可能更合适。由于“扩展的”基因组与宿主相互作用，因此应通过多种方法和技术的组合和整合以复杂的方式研究其代谢，以揭示系统中的关键相互作用并更进一步了解它。代谢组学在研究复杂系统中的功能和扩展肠道微生物代谢方面的知识方面具有巨大潜力。这篇综述展示了一些有关IBD相关研究的例子。代谢组学的最新技术允许检测样品中的数千种代谢物，并且分析技术不断发展。为了研究肠道菌群，应特别注意粪便样品，以模拟微生物群落的功能以及由于其组成变化而对宿主的影响。组合代谢组学中使用的几种分析平台对于此任务至关重要，因为必须检索有关检测到的代谢物特性的最大信息。然后可以将鉴定出的化合物投射到生化途径上，以揭示和解释宿主与微生物代谢之间的交叉点。尽管了解人类的复杂性是一个极具吸引力的观点，但必须使用在生理上可翻译为人类的动物模型进行更具侵入性的研究。因此，考虑可以与人类有机体具有一定相似度并允许追踪宿主内协同相互作用的动物模型非常重要。总体而言，研究肠道菌群已成为越来越有吸引力的研究领域，因为它通过依赖于遗传或环境因素的成分显着影响我们的健康状况（图6）。代谢组学代表了在这项研究中显示出有效的方法之一，本文对代谢组学分析的常见挑战进行了描述。
图6
-
通过肠道菌群影响宿主的各种因素均可导致健康状况或疾病
image.png